Veiligheidsmaatregelen en operationele procedures in een (A) BSL-4 Laboratory: 2. Algemene Practices
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Het werk in een bioveiligheid niveau 4 (BSL-4) containment laboratorium vergt tijd en veel aandacht voor detail. Hetzelfde werk dat wordt gedaan in een BSL-2 laboratorium met non-high-gevolg ziekteverwekkers zullen aanzienlijk langer duren in een BSL-4 setting. Deze verhoogde keer eis is te wijten aan een veelheid van factoren die gericht zijn op het beschermen van de onderzoeker van het laboratorium verworven infecties, de werkomgeving tegen mogelijke besmetting en de lokale gemeenschap van mogelijk vrijkomen van high-gevolg ziekteverwekkers. Binnen het laboratorium, wordt beweging beperkt door luchtslangen aan de verplichte full-body veiligheid past. Daarnaast wordt ontsmet elk item dat uit klasse II Bioveiligheidskasten (BSC) wordt verwijderd vereist. Laboratorium specialisten worden opgeleid in de praktijken van de BSL-4 laboratorium en moet een hoge vaardigheid in de vaardigheden die ze presteren tonen. De focus van dit artikel is om de juiste procedures en technieken om het laboratorium b garanderen schetseniosafety en experimentele nauwkeurigheid met behulp van een standaard virale plaque assay als een voorbeeld procedure. In het bijzonder, de juiste technieken om veilig in een BSL-4 omgeving werken bij het uitvoeren van een experiment visueel worden benadrukt. Deze technieken zijn onder meer: het opzetten van een klasse II BSC voor experimenten, een goede reiniging van de klasse II BSC als u klaar bent werken, afvalbeheer en veilige verwijdering van afval dat wordt gegenereerd in een BSL-4 laboratorium, en het verwijderen van geïnactiveerde monsters van binnen uit een BSL- 4 laboratorium naar de BSL-2 laboratorium.
Introduction
Als de veiligheid van het laboratoriumpersoneel in de behandeling van high-gevolg ziekteverwekkers (geen infectie profylaxe of behandeling opties bestaan) voorop staat, heeft het Amerikaanse Department of Health and Human Services richtlijnen voor facility bouw en best practices voor de veilige uitvoering van het werk gelegd met pathogenen in biomedische en klinische laboratoria vanuit een perspectief bioveiligheid 1. Door middel van wet- en regelgeving, veel van de praktijken en procedures hebben dwingende voorschriften die moeten worden gevolgd voor het werken met deze pathogenen worden. In de VS, ziekteverwekkers die gemakkelijk worden overgedragen van persoon tot persoon, resulteren in een hoge case-fataliteit tarieven, en / of het potentieel voor grote gevolgen voor de volksgezondheid en bioterrorisme, zijn gecategoriseerd als National Institute of Health / Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Disease (NIH / NIAID) Prioriteit A Pathogens en of de Centers for Disease control and Prevention (CDC) Bioterrorisme categorie A Agents 2. Bovendien, hoge-gevolg ziekteverwekkers worden geclassificeerd als Tier 1 Selecteer Agents als deze pathogenen zijn potentiële bioterrorisme agenten, hebben potentieel voor slachtoffers of grote verwoestende gevolgen voor de economie, kritieke infrastructuur, of vertrouwen van het publiek 3.
BSL-4 operaties, waaronder toegang tot instituten met BSL-4 laboratoria, zijn hoger gecontroleerd dan BSL-2/3 operaties. Zo is het aanzienlijk moeilijker om toegang tot een BSL-4 laboratorium vergeleken met een BSL-2 of BSL-3 laboratorium verkrijgen als gevolg van aanzienlijke pak opleidingseisen, uitgebreide mentorship eisen en bijkomende medische bioveiligheid vereisten. Daarnaast zijn er meestal meer fysieke veiligheid barrières in een BSL-4 faciliteit versus een BSL-2 of BSL-3 faciliteit 4-6. Zoals uiteengezet in ons eerste artikel over BSL-4 entry en exit procedures, laboranten ondergaan een uitgebreide opleiding en psychologische screening in aanmerking te komen voor de toegang tot de BSL-4 laboratorium 7. within de BSL-4 laboratorium, het risico van infectie en fouten worden vermeden of beperkt door het volgen van vastgestelde procedures. Onderzoek moet zorgvuldig en weloverwogen te werk gaan, met minimale multitasking of afleiding. Bukken in positieve druk pak is moeilijk, en het gezicht schild kunnen procedures zoals microscopie te beperken. Grof handschoenen belemmeren de prestaties van de fijne motorische taken, zoals het hanteren van kleine voorwerpen of het labelen van buizen. Om de tijd doorgebracht in BSL-4 laboratoria zoveel mogelijk te beperken, moet het laboratorium specialisten beoordelen procedures werken om stappen vooruit te kunnen worden gedaan in een BSL-2 laboratorium te identificeren en vervolgens te transporteren van deze materialen in de BSL-4 laboratorium voor de voltooiing van de taak (s). Bij het verwijderen van materialen voor verdere verwerking in BSL-2 laboratorium worden materialen bevestigd en verwijderd uit de BSL-4 laboratorium in een afgesloten secundaire container. Voorbeelden van monsters die moeten worden verwijderd omvatten: vaste platen of buizen van besmet materiaal wordt geanalyseerd door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescentietest (IFA), of polymerasekettingreactie (PCR).
Naast de grotere fysieke beperkingen opgelegd door persoonlijke beschermingsmiddelen nodig in BSL-4 laboratoria in vergelijking met die in BSL-2 laboratoria, procedures voor inactivatie van high-gevolg pathogenen in celkweek platen en afvalverwerking strenger zijn dan die nodig zijn voor minder pathogene virussen onderzocht in een BSL-2 laboratorium. Op een minimum, moet deze methoden voldoen aan CDC eis. Zo kan verontreinigd celkweekplaten en andere materialen worden geïnactiveerd met chemische reagentia, zoals neutraal gebufferde formaline. Behandelde celkweek platen of buizen zijn via een dunk tank gevuld met een vloeibaar ontsmettingsmiddel in heatseal zakjes met formaline worden geplaatst en verwijderd uit het laboratorium. Afval emmers gevuld met desinfecterende oplossingen en spray ontsmettingsmiddelen worden gebruikt voor het tijdelijk ontvangen van afval dat ontstaat tijdens het experiment en voor Disinfecting handschoenen, het schoonmaken van bioveiligheid kast oppervlakken en instrumenten, respectievelijk. Quaternaire ammonium desinfecterende oplossing bij de genoemde concentratie wordt beschouwd als de gouden standaard voor alle US BSL-4 laboratoria (Barr J, persoonlijke mededeling, 2015). Vast afval uit een emmer wordt geautoclaveerd om mogelijke verontreiniging te elimineren.
In een poging om visueel te tonen de workflow en beperkingen van algemene BSL-4 procedures, gebruikten we een standaard virale plaquetest als voorbeeld van een veelgebruikte virale procedure. Terwijl de virale assay procedure wordt beschreven in het algemeen, benadrukken we de bioveiligheid procedures die worden gebruikt om de veiligheid van het laboratorium personeel te waarborgen in dit protocol. Raadpleeg de vorige klassieke plaque assay visualisaties voor extra achtergrondinformatie over de plaque assay techniek 8,9.
De hier gepresenteerde procedures volgen BMBL specificaties geschetst door CDC 1. De gepresenteerde protocollenspecifiek voor de IRF-Frederick. Elke BSL-4 faciliteit heeft verschillende Standard Operating Procedures (SOP's) en werkmethoden die de uitvoering van experimenten invloed binnen de BSL-4 laboratorium. Alternatieve procedures voor de afvalstroom beheer en de uitvoering van plaque assays kunnen verschillen op basis van het beheer en de exploitatie van deze laboratoria. Toch zal een algemeen begrip van de opzet van een BSL-4 pak laboratorium en procedures voor het uitvoeren van werkzaamheden met klasse II kasten in de BSL-4 milieu te helpen wetenschappers begrijpen van de beperkingen en de gevolgen voor de veiligheid als een patiënte overweegt studies met een hoog risico ziekteverwekkers. Het toegenomen bewustzijn van externe medewerkers van de problemen rond het werk in een BSL-4 laboratorium kan leiden tot aangepaste verwachtingen en meer gemak bij het ontwikkelen van medische tegenmaatregelen in de onderzoekswereld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het werk in een BSL-4 laboratorium vergt veel tijd en extra aandacht voor detail. Elk type van het werk in deze omgeving vereist goed opgeleid, grondig, en gewetensvolle individuen. De standaard virale plaque assay biedt een nauwkeurig model van een gemeenschappelijke procedure voor het werken met high-gevolg ziekteverwekkers in het BSL-4 laboratorium, als de test bestaat uit verschillende belangrijke concepten waarin laboratorium werknemers moet worden getraind.
De eerste belangrijke concep…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
