Säkerhetsåtgärder och rutiner i en (A) BSL-4 Laboratorie: 2. Allmänna metoder
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Arbete i en skyddsnivå 4 (BSL-4) inneslutningslaboratorium kräver tid och stor uppmärksamhet på detaljer. Samma arbete som görs i en BSL-2 laboratorium med icke-high-konsekvens patogener tar betydligt längre i en BSL-4 inställning. Denna ökade krav tid beror på en mängd faktorer som syftar till att skydda forskare från laboratorieförvärvade infektioner, arbetsmiljö från eventuella föroreningar och det lokala samhället från eventuellt frigörande av hög konsekvens patogener. Inne i laboratoriet, är rörelse begränsas på grund av luftslangar kopplade till de obligatoriska hela kroppen säkerhets kostymer. Dessutom krävs desinfektion av alla objekt som tas bort från klass II biosäkerhet skåp (BSC). Laboratoriespecialister måste utbildas i praxis BSL-4 laboratorium och måste visa hög kunskaper i de färdigheter de utför. Fokus i denna artikel är att beskriva lämpliga förfaranden och tekniker för att säkerställa laboratorium Biosafety och experimentell noggrannhet med en vanlig viral plackanalys som ett exempel förfarande. I synnerhet rätt teknik arbeta säkert i en BSL-4 miljö när man utför ett experiment kommer att visuellt understrykas. Dessa tekniker inkluderar: inrätta en klass II BSC för experiment, ordentlig rengöring av klass II BSC när du är klar fungerar, avfallshantering och säker hantering av avfall som genereras i en BSL-4 laboratorium, och avlägsnande av inaktiverade prover från insidan av en BSL- 4 laboratoriet till BSL-2 laboratorium.
Introduction
Som laboratoriepersonalens säkerhet hanterar hög konsekvens patogener (ingen infektion profylax eller behandlingsalternativ finns) är av största vikt, har US Department of Health and Human Services fastställt riktlinjer för anläggning konstruktion och bästa praxis för säker genomförande av arbete med patogener i biomedicinsk och kliniska laboratorier från en biosäkerhet perspektiv en. Genom lagstiftning och reglering, många av de metoder och procedurer har blivit obligatoriska krav som måste följas för arbete med dessa patogener. I USA, patogener som lätt överförs från person till person, resultera i höga fall dödligheten, och / eller har potential för större inverkan på folkhälsan och bioterrorism, kategoriseras som National Institute of Health / National Institute of Allergy och Infectious sjukdom (NIH / NIAID) Prioritet A Pathogens och eller Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorism Kategori A Agents 2. Dessutom hög-konsekvens patogener klassificeras som Tier 1 Välj ombud om dessa patogener är potentiella bioterrorism agenter, har potential för mass olyckor eller förödande effekter på ekonomin, kritisk infrastruktur eller allmänhetens förtroende 3.
BSL-4 verksamhet, inklusive tillgång till institut med BSL-4 laboratorier, är mer mycket kontrollerad än BSL-2/3 operationer. Till exempel, är det betydligt svårare att få tillgång till en BSL-4 laboratorium jämfört med en BSL-2 eller BSL-3 laboratorium på grund av väsentliga krav passa utbildning, omfattande mentorskap krav, och ytterligare medicinsk biosäkerhet förutsättningar. Dessutom finns det oftast mer fysiska säkerhetsbarriärer i BSL-4 anläggning mot en BSL-2 eller BSL-3 anläggning 4-6. Som beskrivs i vår första artikel om förfaranden BSL-4 infarter och utfarter laboratoriepersonalen genomgå omfattande utbildning och psykologisk screening för att kvalificera för inträde i BSL-4 laboratorium 7. Wnom BSL-4 laboratorium, är risken för infektion och misstag undvikas eller mildras genom att följa etablerade procedurer. Forskningen måste gå försiktigt och medvetet, med minimal multitasking eller distraktioner. Böjd över i positiv tryckdräkter är svårt, och ansiktsskydd kan begränsa procedurer såsom mikroskopi. Skrymmande handskar hindra utförandet av finmotoriska uppgifter, såsom hantering av små föremål eller märkning rör. För att minimera tiden i BSL-4 laboratorier, bör laboratorie specialister granskar arbetssätt för att identifiera åtgärder som kan göras i förväg i en BSL-2 laboratorium och sedan transportera dessa material i BSL-4 laboratorium för slutförande av uppgiften (s). När du tar bort material för vidare bearbetning i BSL-2 laboratorium, är material fixeras och avlägsnas från BSL-4 laboratorium i en förseglad sekundära behållaren. Exempel på prover som kan behöva tas bort innefattar: fasta plattor eller rör av infekterat material som kommer att analyseras genom enzymkopplad immunosorbent analys (ELISA), immunfluorescensanalys (IFA), eller polymeraskedjereaktion (PCR).
Förutom större fysiska begränsningar som personlig skyddsutrustning som krävs i BSL-4 laboratorier jämfört med dem i BSL-2 laboratorier, förfaranden för inaktivering av hög konsekvens patogener i cellodlingsplattor och avfallshantering är strängare än de som krävs för mindre patogena virus studeras i en BSL-2 laboratorium. Åtminstone bör dessa metoder uppfyller CDC krav. Till exempel kan kontaminerade cellodlingsplattor och annat material inaktiveras med kemiska reagens, såsom neutral-buffrat formalin. Behandlade cellodlingsplattor eller rör som skall placeras i värmeförseglings påsar innehållande formalin och avlägsnas från laboratoriet via en dunk tank fylld med en flytande desinfektionsmedel. Avfalls hinkar fyllda med desinficerande lösningar och spray desinfektionsmedel används för att temporärt ta emot avfall som genereras under experimentet och för DISInfecting handskar, rengöring biosäkerhet skåp ytor och instrument, respektive. Kvartar ammonium desinfektionsmedel lösning på koncentration listas anses den gyllene standarden för alla amerikanska BSL-4 laboratorier (Barr J, personlig kommunikation, 2015). Fast avfall från en avfallshinken autoklaveras för att eliminera risken för förorening.
I ett försök att visuellt visa arbetsflödet och begränsningar allmänna BSL-4 förfaranden, använde vi en standard viral plackanalys som ett exempel på en vanligt förekommande viral förfarande. Medan virusanalysförfarandet beskrivs i allmänhet, vi betona om biosäkerhet metoder som används för att garantera säkerheten för laboratoriepersonal i detta protokoll. Se tidigare klassiska plack analys visualiseringar för ytterligare bakgrund på plackanalystekniken 8,9.
De förfaranden som presenteras här följer BMBL specifikationer som anges av CDC 1. Emellertid de presenterade protokollen ärspecifika för IRF-Fredrik. Varje BSL-4 Anläggningen har olika standardrutiner (SOP) och arbetssätt som påverkar genomförandet av experiment inom BSL-4 laboratorium. Alternativa förfaranden för avfallsflödet hantering och utförande av plackanalyser kan variera beroende på förvaltning och drift av dessa laboratorier. Trots det kommer en allmän förståelse för installationen av en BSL-4 kostym laboratorium och förfaranden för att utföra arbetet med klass II skåp inne i BSL-4 miljö hjälpa forskarna att förstå de begränsningar och säkerhetskonsekvenser när de överväger studier av högrisk patogener. Ökad medvetenhet om externa medarbetare av svårigheterna i arbete i en BSL-4 laboratorium kan leda till justerade förväntningar och större lätthet i att utveckla medicinska motåtgärder i forskarsamhället.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbete i en BSL-4 laboratorium kräver betydande tid och ytterligare uppmärksamhet på detaljer. Alla typer av arbete i denna miljö kräver välutbildade, noggrann och samvetsgranna människor. Standarden viral plackanalys ger en exakt modell av ett gemensamt förfarande för att arbeta med hög konsekvens patogener i BSL-4 laboratorium, som analysen omfattar flera stora koncept där laboratoriepersonal måste utbildas.
Den första stora konceptet är korrekt användning och tillämpning a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
