은 C-FOS 단백질 면역 조직 검색 : 특정 생리적 반응에 관여 중앙 진학의 마커로서 유용한 도구<em> 생체</em> 및<em> 전의 VIVO</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
많은 연구는 특정 생리 규정과 관련된 뇌 영역을 식별 매핑 구한다. 프로토-종양 유전자 C-FOS, 즉시 초기 유전자는 다양한 자극에 반응하여 신경 세포로 표현된다. 단백질 생성물을 용이하게 그 활성의 변화를 표시 뉴런의 그룹을 매핑하는 C-FOS 검출의 사용에 이르는 면역 기술로 검출 할 수있다. 이 글에서, 우리는 저산소증 또는 탄산 혈증에 환기 적응에 관여하는 뇌간 신경 인구의 식별에 초점을 맞추었다. 두 가지 방법은 동물의 생체 내에서 관련 신경 세포 인구를 식별하기 위해 설명하고, 생체 deafferented 뇌간 준비한다. 생체 내, 동물. hypercapnic 또는 저산소 가스 혼합물에 노출 된 예 생체 내, deafferented 준비가 저산소 또는 hypercapnic 인공 뇌척수액으로 superfused했다. 두 경우 모두, 하나 제어 생체 내 동물 또는 전자에X 생체 준비가 정상 산소와 normocapnic 조건에서 유지 하였다. 이 두 가지 방법의 비교는 신경 세포의 활성화, 즉의 기원의 결정을 할 수 있습니다 주변 및 / 또는 중앙. 생체 내 및 생체 외, brainstems가 수집, 고정 및 섹션으로 분리되었다. 섹션 제조 하였다되면, C-FOS 단백질의 면역 검출을 저산소 또는 hypercapnic 자극에 의해 활성화 된 세포의 뇌간 그룹을 식별하기 위해 만들어졌다. 레이블이 세포는 뇌간 호흡 구조에서 계산되었다. 상기 제어 조건, 저산소증 또는 고탄 산혈증에 비해 따라서 중앙 호흡 드라이브의 적응에 관여하는 신경 전달 경로의 여러 가지 구조적 뇌간 특정 부위에서 C-FOS 표지화 된 세포의 수가 증가 하였다.
Introduction
C- FOS 유전자 1980 1,2 초에 처음 동정 및 유전자 생성물 활성제 특성을 갖는 3,4- 핵 단백질로서 1984 년에 나타내었다. 그것은 신경 자극과 관련된 장기 메커니즘에 참여하고 있습니다. 사실, 신경 활동의 변화는 전사 인자 C-FOS의 생산을 유도 즉시 초기 유전자 C-FOS의 발현을 유도 두 번째 메신저 신호 폭포로 이어집니다. 후자는 늦은 유전자의 발현을 개시함으로써 자극 (4)의 여러 유형의 신경 시스템의 적응 반응에 참여한다. 따라서, 1980 5,6- 말부터, C-FOS 단백질 검출 자주 신경 경로를 매핑하기위한 일반 4 및 중추 신경계 (CNS)의 활성을 유전자 전사에 외생 적 요인의 영향을 연구하기 위해 사용되어왔다 다른 생리에 관여알 조건.
기초 C-FOS 표현은 쥐, 쥐, 고양이, 원숭이, 인간 4 등 다양한 종에서 연구되어왔다. 이로써, 그 표현의 역학은 비교적 잘 알려져있다. 전사 활성화 (5~20 분) 7,8 급이며 mRNA의 축적은 자극 (9)의 발병 후 30 및 45 분 사이에서 최대 값에 도달하고 12 분의 짧은 반감기로 감소한다. 은 C-FOS의 단백질 합성은 mRNA의 축적을 다음 20 ~ 90 분 후 자극 6에서 면역 조직 화학 염색에 의해 검출 될 수있다.
C-FOS 발현 분석 고전 저산소 혈증 또는 10-14에 환기 반응과 관련된 중추 호흡 네트워크를 식별하기 위해 생체 내 연구에 사용된다. 최근에,이 도구는 저산소증 또는 시간에 중앙 호흡 네트워크 적응을 탐구하는 생체 뇌간 준비에 사용 된ypercapnia 15-18. 사실, 이러한 준비는 고전적인 중앙 호흡기 드라이브 (19)에 동화 리듬 활동을 생성합니다. 따라서, 제제의 유형이 완전히 deafferented되는 장점을 가지며, 따라서, C-FOS 발현에 관한 결과는 주변 구조물의 개입없이 중앙의 자극의 결과를 반영한다.
은 C-FOS 검출은 면역 조직 화학 또는 immunohistofluorescence 방법에 의해 제조 될 수있다. 간접 면역은 C-FOS에 대한 일차 항체와 차 항체를 생성시킨 종 향한 이차 항체의 사용을 필요로한다. 면역 조직 화학적 방법의 경우, 이차 항체는 기판 (퍼 옥시다아제를위한 H 2 O 2)에 작용하는 효소 (예 : 퍼 옥시 다제)와 결합된다. 효소 반응의 생성물은 크로 모겐 (3,3- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochlorid 의해 개발전자), 어떤을 얼룩과 광학 현미경으로 관찰 할 수있다. 반응은 니켈, 황산 암모늄을 사용하여 강화 될 수있다. 이러한 방법은 다른 생리 학적 문제 중 활성 뉴런의 검출에 따라서, 식별 및 / 또는 연속 된 생리적 반응과 관련된 주변과 중앙 통로의 맵핑을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C-FOS 즉각적인 초기 유전자와 그 산물의 검출은 상기 C-FOS 단백질, 고전 생체 11,13,25,28 특정 호흡기 반응에 관여하는 신경 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 생체 16-18 27,32,33.
프로토콜 내에서 중요한 단계
재관류 단계에서주의해야합니다. 4 % PFA 솔루션은 잘 준비되어야하며 고정 및 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
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