بروتين ج-FOS كشف Immunohistological: أداة مفيدة كعلامة للممرات الوسطى تشارك في الاستجابات الفسيولوجية محددة<em> في فيفو</em> و<em> فيفو السابقين</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
تسعى العديد من الدراسات لتحديد ورسم خريطة لمناطق الدماغ تشارك في أنظمة فسيولوجية معينة. ج-فو-بروتو الجين الورمي، جين الفورية المبكرة، وأعرب في الخلايا العصبية في استجابة للمؤثرات المختلفة. المنتج البروتين يمكن أن يتم الكشف بسهولة مع تقنيات المناعى مما يؤدي إلى استخدام الكشف ج-مكتب الإحصاء الاتحادي في الخريطة مجموعات من الخلايا العصبية التي تعرض التغيرات في نشاطهم. في هذه المقالة، ركزنا على تحديد الدماغ العصبية السكان المعنيين في التكيف التنفس الصناعي لنقص الأكسجين أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم. وقد وصفت نهجين لتحديد السكان العصبية تشارك في الجسم الحي في الحيوانات والمجراة سابقا في الأعمال التحضيرية الدماغ deafferented. في الجسم الحي، تعرضت الحيوانات لخليط الغاز بفرط ثنائي أكسيد الكربون أو ميتة. خارج الحي، وsuperfused الاستعدادات deafferented مع نقص الأوكسجين أو بفرط ثنائي أكسيد الكربون السائل النخاعي الاصطناعي. في كلتا الحالتين، إما السيطرة في الحيوانات الحية أو البريدكان مسك س الجسم الحي الاستعدادات في ظل ظروف normoxic وnormocapnic. المقارنة بين هذين النهجين تسمح بتحديد أصل تفعيل أي الخلايا العصبية، الطرفية و / أو وسط. في الجسم الحي وخارج الحي، وقد تم جمع brainstems، ثابتة، وشرائح إلى أقسام. مرة واحدة وقد تم إعداد أقسام، وجاء كشف المناعى من البروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي من أجل تحديد الفئات الدماغ من خلايا تفعيلها من خلال التحفيز ميتة أو بفرط ثنائي أكسيد الكربون. احصي الخلايا المسمى في هياكل الجهاز التنفسي الدماغ. بالمقارنة مع حالة السيطرة، نقص الأكسجة أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم زيادة عدد ج-FOS الخلايا المسمى في عدة مواقع الدماغ المحددة التي التأسيسي للمسارات العصبية المعنية في التكيف من محرك الأقراص التنفسي المركزي الآن.
Introduction
تم التعرف على الجين مكتب الإحصاء الاتحادي ج- للمرة الأولى في بداية عام 1980 1،2 و تميزت منتجاتها في عام 1984 كما بروتين النووي لديه خصائص الجينات المنشط 3،4. وتشارك في آليات طويلة الأجل المرتبطة تحفيز الخلايا العصبية. في الواقع، والتغيرات في نشاط الخلايا العصبية تؤدي إلى رسول يشير الثانية الشلالات التي تحفز على التعبير عن الجينات في وقت مبكر ج-مكتب الإحصاء الاتحادي الفورية، وهو الحث على إنتاج عامل النسخ ج-مكتب الإحصاء الاتحادي. هذا الأخير يبدأ التعبير عن الجينات في وقت متأخر وبالتالي يشارك في الاستجابات التكيفية للجهاز العصبي إلى العديد من أنواع مختلفة من المحفزات 4. وهكذا، منذ نهاية عام 1980 5،6، وقد استخدمت ج-FOS كشف عن البروتين في كثير من الأحيان لدراسة تأثير العوامل الخارجية على النسخ الجيني في عام (4) وعلى نشاط الجهاز العصبي المركزي (CNS) لرسم خرائط من الممرات العصبية تشارك في فيزيولوجي مختلفةالظروف الله.
وقد تمت دراسة القاعدية التعبير ج منظمات المزارعين في مختلف الأنواع بما في ذلك الفئران، الفئران والقطط والقرود، والإنسان (4). وبالتالي، حركية التعبير عنها هو معروف جيدا نسبيا. تفعيل النسخ السريع (من 5 إلى 20 دقيقة) 7،8، وتراكم مرنا يصل كحد أقصى بين 30 و 45 دقيقة بعد بداية التحفيز 9 وينخفض مع نصف عمر قصير من 12 دقيقة. تخليق البروتين ج-مكتب الإحصاء الاتحادي في أعقاب تراكم مرنا، ويمكن أن يتم الكشف من قبل المناعية من 20 إلى 90 دقيقة بعد التحفيز 6.
ويستخدم تحليل التعبير ج منظمات المزارعين كلاسيكيا في الدراسات المجراة لتحديد شبكة الجهاز التنفسي المركزية تشارك في الردود التهوية لنقص الأكسجة أو فرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم 10-14. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام هذه الأداة أيضا في خارج الحي الاستعدادات الدماغ لاستكشاف التعديلات شبكة الجهاز التنفسي المركزية لنقص الأكسجين أو حypercapnia 15-18. في الواقع، هذه الاستعدادات تولد النشاط الإيقاعي استيعابهم الكلاسيكي إلى محرك الأقراص التنفسي المركزي 19. وبالتالي، فإن هذا النوع من التحضير لديه ميزة كونها deafferented تماما، وبالتالي، النتائج المتعلقة التعبير ج منظمات المزارعين تعكس سوى النتائج المترتبة على التحفيز المركزي دون أي تدخل من الهياكل الطرفية.
يمكن إجراء الكشف ج-FOS بنهج المناعى أو تألق نسيجي مناعي. مناعي غير المباشرة يتطلب استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد ج-FOS والأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد الأنواع التي كانت تنتج الأجسام المضادة الأولية. للتعرف على طريقة المناعى، ومترافق الأجسام المضادة الثانوية مع انزيم (البيروكسيديز، على سبيل المثال) التي تعمل على ركيزة (H 2 O 2 لالبيروكسيديز). تم تطوير هذا المنتج من رد الفعل الأنزيمية قبل مولد اللون (3.3 diaminobenzidine tetrahydrochloridه)، التي بقع عليها ويمكن ملاحظتها تحت المجهر الضوئي. يمكن تعزيز التفاعل باستخدام كبريتات النيكل الأمونيوم. هذه الأساليب تسمح للكشف الأصول الخلايا العصبية خلال التحديات الفسيولوجية المختلفة، وبالتالي تحديد و / أو رسم خرائط لمسارات الطرفية والمركزية تشارك في الاستجابات الفسيولوجية متتالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
C-مكتب الإحصاء الاتحادي هو جين الفورية المبكرة، والكشف عن منتجاتها، وبروتين ج-FOS، يستخدم تقليديا لتحديد السكان العصبية المعنية في ردود الجهاز التنفسي محددة في الجسم الحي 11،13،25،28 وخارج الجسم الحي 16-18، 27،32،33.
<p class="jove_content" style=";text-a…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat’s neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neurosciences. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neurosciences. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neurosciences. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neurosciences. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
