De c-FOS Protein Immunohistologische Detection: Een handig hulpmiddel als een marker van Central Pathways betrokken bij specifieke fysiologische reacties<em> In Vivo</em> en<em> Ex Vivo</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
Veel studies trachten de hersengebieden die betrokken zijn bij specifieke fysiologische regelgeving te identificeren en in kaart. Het proto-oncogen c-fos, een onmiddellijk vroege gen, tot expressie wordt gebracht in neuronen in reactie op verschillende stimuli. Het eiwitproduct kan gemakkelijk worden gedetecteerd met immunohistochemische technieken waardoor het gebruik van c-FOS detectie groepen neuronen die veranderingen in hun activiteit weergave-afbeelding. In dit artikel hebben we ons gericht op de identificatie van hersenstam neuronale populaties die betrokken zijn bij de ademhaling aanpassing aan hypoxie of hypercapnie. Twee benaderingen beschreven om mee neuronale populaties te identificeren in vivo bij dieren en ex vivo in deafferented hersenstam preparaten. In vivo dieren werden blootgesteld aan hypercapnische of hypoxische gasmengsels. Ex vivo werden deafferented preparaten superfused met hypoxische of hypercapnische kunstmatige cerebrospinale vloeistof. In beide gevallen, zowel in vivo controle dieren of ex vivo preparaten werden onder normoxische en normocapnic voorwaarden gehandhaafd. De vergelijking van deze twee benaderingen maakt de bepaling van de oorsprong van de neuronale dwz perifere en / of centrale. In vivo en ex vivo, brainstems verzameld, gefixeerd en in secties gesneden. Zodra secties werden bereid, werd immunohistochemische detectie van het c-fos eiwit gemaakt om de hersenstam groepen cellen geactiveerd door hypoxische of hypercapnische stimulaties identificeren. Gelabelde cellen werden geteld in hersenstam respiratoire structuren. In vergelijking met de controlegroep, hypoxie of hypercapnie verhoogde het aantal c-FOS gemerkte cellen in verschillende specifieke hersenstam sites die aldus constitutief van de zenuwbanen die bij de aanpassing van de centrale ademhalingscentrum zijn.
Introduction
Het c-fos gen werd geïdentificeerd voor het eerst aan het begin van 1980 1,2 en het product werd gekarakteriseerd in 1984 als nucleair eiwit met gen-activator eigenschappen 3,4. Hij neemt deel aan de lange termijn mechanismen geassocieerd met neuron stimulatie. Inderdaad, veranderingen in neuronale activiteit tot second messenger signalerende cascades die de expressie van het directe vroege gen c-fos, die de productie van de transcriptiefactor c-FOS induceert induceren. De laatste initieert de expressie van late genen en derhalve deel aan adaptieve responsen van het zenuwstelsel van vele verschillende soorten stimuli 4. Aldus, sinds eind 1980 5,6, c-FOS eiwitdetectie is vaak gebruikt om de effecten van exogene factoren op gentranscriptie in het algemeen 4 en op de activiteit van het centrale zenuwstelsel (CNS) studeren kaart brengen zenuwbanen betrokken bij verschillende fysiologischeal omstandigheden.
Basale c-fos-expressie is onderzocht in diverse species waaronder muizen, ratten, katten, apen en humane 4. Daardoor wordt de kinetiek van de expressie vrij goed bekend. De transcriptie-activering is snel (5 tot 20 min) 7,8 en de mRNA accumulatie bereikt een maximum tussen 30 en 45 minuten na het begin van stimulatie 9 en afneemt met een korte halfwaardetijd van 12 min. De c-FOS eiwitsynthese volgt accumulatie van mRNA en door immunohistochemie kan worden gedetecteerd bij 20 tot 90 min na stimulatie 6.
Analyse van c-fos-expressie is klassiek gebruikt in in vivo studies om de centrale respiratoire netwerk betrokken zijn bij de ademhaling responsen op hypoxie of hypercapnie 10-14 identificeren. Meer recent werd dit instrument ook gebruikt in ex vivo hersenstam voorbereidingen naar het centrum van de luchtwegen netwerk aanpassingen aan hypoxie of h te verkennenypercapnia 15-18. Sterker nog, deze voorbereidingen genereren een ritmische activiteit klassiek gelijkgesteld aan de centrale luchtwegen aandrijving 19. Dus dit soort preparaat heeft het voordeel dat volledig deafferented en derhalve resultaten met betrekking tot c-fos expressie de gevolgen van een centrale stimulatie geven alleen zonder tussenkomst van perifere structuren.
De c-FOS detectie daarin van immunohistochemische of immunohistofluorescence benaderingen. Indirecte immunodetectie vereist het gebruik van een primair antilichaam tegen c-FOS en een secundair antilichaam gericht tegen de soorten waarbij het primaire antilichaam werd geproduceerd. Voor de immunohistochemische methode wordt het secundaire antilichaam geconjugeerd met een enzym (peroxidase, bijvoorbeeld) die inwerkt op een substraat (H 2 O 2 voor peroxidase). Het product van de enzymatische reactie wordt ontwikkeld door een chromogeen (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride), die vlekken en onder lichtmicroscopie worden waargenomen. De reactie kan worden versterkt met behulp van nikkel ammoniumsulfaat. Deze werkwijzen maken de detectie van actieve neuronen in verschillende fysiologische problemen en dus de identificatie en / of het in kaart brengen van perifere en centrale routes betrokken bij de opeenvolgende fysiologische reacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
C-fos is een directe vroege gen, en de detectie van het product, de c-fos-eiwit, is klassiek gebruikt om neuronale populaties betrokken bij specifieke respiratoire responsen in vivo 11,13,25,28 identificeren en ex vivo 16-18, 27,32,33.
Kritische stappen in het Protocol
Wees voorzichtig tijdens de perfusie stap. De 4% PFA oplossing moet goed worden voorbereid en de fixatie en post-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
References
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
- Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
- Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
- Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
- Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
- Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
- Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
- Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
- Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
- Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
- Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat’s neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
- Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neurosciences. 108, 643-653 (2001).
- Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
- Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
- Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neurosciences. 132, 843-854 (2005).
- Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
- Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neurosciences. 194, 95-111 (2011).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
- Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
- Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
- Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
- Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
- Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
- Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
- Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
- Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
- Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
- Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neurosciences. 127, 505-518 (2004).
- Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
- Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
- Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
- Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).
