सी-FOS प्रोटीन Immunohistological जांच: एक उपयोगी उपकरण केंद्रीय रास्ते विशिष्ट शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल की एक मार्कर के रूप में<em> Vivo</em> और<em> पूर्व विवो</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
कई अध्ययनों से पहचान करने और मस्तिष्क विशिष्ट शारीरिक नियमों में शामिल क्षेत्रों नक्शा करने के लिए करना चाहते हैं। आद्य ओंकोजीन सी FOS, एक तत्काल जल्दी जीन, विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है। प्रोटीन उत्पाद आसानी से प्रतिरक्षाऊतकरसायन सी FOS का पता लगाने का उपयोग न्यूरॉन्स कि उनकी गतिविधि में परिवर्तन प्रदर्शित के समूहों को मैप करने के लिए अग्रणी तकनीक के साथ पाया जा सकता है। इस अनुच्छेद में, हम हाइपोक्सिया या hypercapnia करने के लिए जीवन रक्षक प्रणाली अनुकूलन में शामिल brainstem neuronal आबादी की पहचान पर ध्यान केंद्रित किया। दो दृष्टिकोण पशुओं में विवो में शामिल neuronal आबादी की पहचान करने में वर्णित किया गया है और deafferented brainstem तैयारी में पूर्व vivo। में विवो, जानवरों hypercapnic या hypoxic गैस के मिश्रण से अवगत कराया गया। पूर्व vivo, deafferented तैयारियों hypoxic या hypercapnic कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के साथ superfused थे। दोनों ही मामलों में, या तो विवो जानवरों या ई में नियंत्रणएक्स विवो तैयारियों normoxic और normocapnic की शर्तों के तहत बनाए रखा गया। इन दो दृष्टिकोणों की तुलना न्यूरोनल सक्रियण यानी की उत्पत्ति, के निर्धारण की अनुमति देता परिधीय और / या केंद्रीय। में vivo और पूर्व vivo, brainstems, एकत्र किए गए थे तय है, और वर्गों में कटा हुआ। एक बार जब वर्गों तैयार थे, सी-FOS प्रोटीन का पता लगाने के आदेश प्रतिरक्षाऊतकरसायन hypoxic या hypercapnic stimulations से सक्रिय कोशिकाओं के brainstem समूहों की पहचान करने के लिए बनाया गया था। लेबल की कोशिकाओं brainstem सांस की संरचनाओं में गिना रहे थे। नियंत्रण हालत, हाइपोक्सिया या hypercapnia की तुलना में कई विशिष्ट brainstem साइटों है कि इस प्रकार न्यूरोनल केंद्रीय सांस की ड्राइव के अनुकूलन में शामिल रास्ते के विधान में सी-FOS लेबल की कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई।
Introduction
सी FOS जीन 1980 1,2 की शुरुआत में पहली बार के लिए पहचान की थी और अपने उत्पाद को एक परमाणु प्रोटीन जीन-उत्प्रेरक गुण 3,4 होने के रूप में 1984 में विशेषता थी। यह लंबी अवधि के न्यूरॉन उत्तेजना के साथ जुड़े तंत्र में भाग लेता है। दरअसल, neuronal गतिविधि में परिवर्तन का दूसरा दूत cascades संकेत है कि तत्काल जल्दी जीन सी FOS की अभिव्यक्ति है, जो प्रतिलेखन कारक सी FOS के उत्पादन लाती प्रेरित करने के लिए नेतृत्व। उत्तरार्द्ध देर जीनों की अभिव्यक्ति शुरू की है और इस तरह उत्तेजनाओं 4 के कई अलग अलग प्रकार के तंत्रिका तंत्र के अनुकूली प्रतिक्रियाओं में भाग लेता है। इस प्रकार, 1980 5,6 के अंत के बाद से, सी-FOS प्रोटीन का पता लगाने अक्सर सामान्य 4 में और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की गतिविधि पर जीन प्रतिलेखन पर बहिर्जात कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए neuronal रास्ते बाहर मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया है विभिन्न शारीरिक में शामिलअल शर्तों।
बेसल सी FOS अभिव्यक्ति चूहे, चूहे, बिल्ली, बंदर, और मानव 4 सहित विभिन्न प्रजातियों में अध्ययन किया गया है। इस प्रकार, अपनी अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स अपेक्षाकृत अच्छी तरह से जाना जाता है। प्रतिलेखन सक्रियण तेजी से होता है (5 से 20 मिनट) 7,8, और mRNA संचय उत्तेजना 9 के शुरू होने के बाद 30 और 45 मिनट के बीच एक अधिकतम तक पहुँच जाता है और 12 मिनट की एक लघु आधा जीवन के साथ गिरावट आती है। सी-FOS प्रोटीन संश्लेषण mRNA संचय के बाद और 20 से 90 मिनट पद उत्तेजना 6 पर immunohistochemistry से पता लगाया जा सकता है।
सी-FOS अभिव्यक्ति का विश्लेषण प्रतिष्ठित हाइपोक्सिया या hypercapnia 10-14 के लिए जीवन रक्षक प्रणाली प्रतिक्रियाओं में शामिल केंद्रीय श्वसन नेटवर्क की पहचान करने में vivo अध्ययन में प्रयोग किया जाता है। अभी हाल ही में इस उपकरण भी पूर्व vivo brainstem की तैयारी में इस्तेमाल किया गया था हाइपोक्सिया या एच के लिए केंद्रीय श्वसन नेटवर्क रूपांतरों का पता लगाने के लिएypercapnia 15-18। दरअसल, इन तैयारियों एक लयबद्ध गतिविधि प्रतिष्ठित केंद्रीय श्वसन ड्राइव 19 को आत्मसात उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार, तैयारी के इस प्रकार पूरी तरह से deafferented होने का फायदा है, और इसलिए, सी-FOS अभिव्यक्ति के बारे में परिणाम केवल परिधीय संरचनाओं के किसी भी हस्तक्षेप के बिना एक केंद्रीय उत्तेजना के परिणामों को प्रतिबिंबित।
सी-FOS पता लगाने प्रतिरक्षाऊतकरसायन या immunohistofluorescence दृष्टिकोण से बनाया जा सकता है। अप्रत्यक्ष immunodetection सी FOS के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी और एक माध्यमिक एंटीबॉडी प्रजातियों जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी का उत्पादन किया गया था के खिलाफ निर्देशित का उपयोग जरूरी है। प्रतिरक्षाऊतकरसायन विधि के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी एक एंजाइम (peroxidase, उदाहरण के लिए) है कि एक सब्सट्रेट (एच 2 ओ 2 peroxidase के लिए) पर काम करता है के साथ संयुग्मित है। enzymatic प्रतिक्रिया के उत्पाद एक वर्णकोत्पादक (3.3-diaminobenzidine tetrahydrochlorid द्वारा विकसित की हैई) है, जो यह दाग और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत देखा जा सकता है। प्रतिक्रिया निकल अमोनियम सल्फेट का उपयोग कर मजबूत बनाया जा सकता है। इन विधियों विभिन्न शारीरिक चुनौतियों के दौरान सक्रिय न्यूरॉन्स का पता लगाने और इसलिए पहचान और / या लगातार शारीरिक प्रतिक्रियाओं में शामिल परिधीय और केंद्रीय रास्ते में से मानचित्रण अनुमति देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सी-FOS एक तत्काल जल्दी जीन है, और अपने उत्पाद का पता लगाने, सी-FOS प्रोटीन, प्रतिष्ठित न्यूरोनल विवो 11,13,25,28 में विशिष्ट सांस की प्रतिक्रियाओं में शामिल आबादी की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
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