La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em> In Vivo</em> e<em> Ex Vivo</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
Molti studi cercano di identificare e mappare le regioni del cervello coinvolte nella specifica normativa fisiologici. I c-fos proto-oncogene, un gene precoce immediato, è espressa nei neuroni in risposta a vari stimoli. Il prodotto proteina può essere facilmente rilevata con tecniche immunoistochimiche volti all'utilizzo di rilevamento c-FOS mappare gruppi di neuroni che mostrano cambiamenti nella loro attività. In questo articolo, ci siamo concentrati sull'individuazione di tronco cerebrale neuronale popolazioni coinvolte nell'adattamento ventilatoria all'ipossia o ipercapnia. Due approcci sono stati descritti per identificare popolazioni neuronali coinvolte in vivo negli animali e ex vivo nelle preparazioni del tronco deafferented. In vivo, gli animali sono stati esposti a miscele di gas ipercapnici o ipossia. Ex vivo, i preparativi sono stati deafferented superfused con ipossia o liquido cerebrospinale artificiale ipercapnica. In entrambi i casi, sia il controllo de animali in vivo o ex vivo i preparativi sono stati mantenuti in condizioni normossiche e normocapnica. Il confronto di questi due approcci permette di determinare l'origine del cioè attivazione neuronale, periferica e / o centrale. In vivo ed ex vivo, sono stati raccolti brainstems, fissi, e tagliati in sezioni. Una volta che le sezioni sono state preparate, rilevazione immunoistochimica della proteina c-FOS è stato fatto per identificare i gruppi tronco di cellule attivate da stimoli ipossici o ipercapnici. cellule marcate sono state contate in strutture respiratori del tronco cerebrale. Rispetto alla condizione di controllo, ipossia o ipercapnia aumentato il numero di cellule marcate c-FOS in diversi siti del tronco specifici che sono in tal modo costitutiva dei percorsi neuronali coinvolti nella adattamento del drive respiratorio centrale.
Introduction
Il gene fos c- è stato identificato per la prima volta all'inizio del 1980 1,2 e il suo prodotto è stato caratterizzato nel 1984 come una proteina nucleare avente proprietà gene-attivatore 3,4. Partecipa a meccanismi a lungo termine associati con la stimolazione dei neuroni. Infatti, cambiamenti nell'attività neuronale portano a seconda cascata di segnalazione messaggero che inducono l'espressione dei geni immediati precoce c-fos, che induce la produzione del fattore di trascrizione c-FOS. Quest'ultima avvia l'espressione dei geni tardivi e partecipa quindi in risposta adattativa del sistema nervoso a diversi tipi di stimoli 4. Così, dalla fine del 1980 5,6, rilevamento proteina c-fos è stato frequentemente utilizzato per studiare gli effetti di fattori esogeni sulla trascrizione genica in generale 4 e sull'attività del sistema nervoso centrale (CNS) per mappatura percorsi neuronali coinvolti in diversi fisiologicacondizioni al.
Basale c-fos espressione è stata studiata in varie specie, tra cui topi, ratti, gatti, scimmie, e umano 4. In tal modo, la cinetica della sua espressione è relativamente ben nota. L'attivazione della trascrizione è rapido (da 5 a 20 min) 7,8, e l'accumulo di mRNA raggiunge un massimo tra 30 e 45 minuti dopo l'inizio della stimolazione 9 e diminuisce con una breve emivita di 12 min. La sintesi proteica c-FOS segue accumulo di mRNA e potrebbe essere rilevato mediante immunoistochimica a 20 a 90 min dopo la stimolazione 6.
Analisi dell'espressione di c-fos è classicamente utilizzato in studi in vivo per identificare la rete dell'apparato respiratorio coinvolti nelle risposte ventilatoria all'ipossia o ipercapnia 10-14. Più di recente, questo strumento è stato utilizzato anche in preparazioni ex vivo tronco di esplorare adattamenti rete respiratorie centrali all'ipossia o hypercapnia 15-18. In effetti, questi preparati generano un'attività ritmica classicamente assimilata al drive respiratorio centrale 19. Pertanto, questo tipo di preparazione ha il vantaggio di essere completamente deafferented, e quindi, i risultati riguardanti l'espressione di c-fos solo riflettono le conseguenze di una stimolazione centrale senza alcun intervento di strutture periferiche.
Il rilevamento c-FOS può essere effettuato mediante approcci immunoistochimiche o immunohistofluorescence. immunolocalizzazione indiretta richiede l'uso di un anticorpo primario contro c-FOS e un anticorpo secondario diretto contro le specie in cui è ottenuto l'anticorpo primario. Per il metodo immunoistochimica, l'anticorpo secondario è coniugato con un enzima (perossidasi, per esempio) che agisce su un substrato (H 2 O 2 per la perossidasi). Il prodotto della reazione enzimatica è sviluppato da un cromogeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), che colora e si osserva al microscopio ottico. La reazione potrebbe essere rafforzata con solfato di nichel ammonio. Questi metodi consentono il rilevamento di attivi neuroni durante diverse sfide fisiologici e quindi l'identificazione e / o la mappatura dei percorsi periferiche e centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche consecutivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
C-fos è un gene precoce immediato, e il rilevamento del suo prodotto, la proteina c-FOS, viene classicamente utilizzati per identificare popolazioni neuronali coinvolti nelle risposte respiratorie specifici in vivo ed ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33.
I passaggi critici all'interno del protocollo
Fare attenzione durante la fase di perfusione. La soluzione PFA 4% deve esser…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
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