C-FOSタンパク質免疫組織学的検出：特定の生理反応に関与する中央経路のマーカーとして有用ツール<em>インビボ</em>と<em> ex vivoで</em
Summary
Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
Abstract
多くの研究は、特定の生理的な規制に関与する脳領域を特定し、マップしようとしています。癌原遺伝子C-FOS、前初期遺伝子は、種々の刺激に応答してニューロンで発現されます。タンパク質生成物は、容易にそれらの活性の変化を表示するニューロンのグループをマップするC-FOSの検出の使用につながる、免疫組織化学的技術を用いて検出することができます。この記事では、低酸素症または高炭酸ガスに換気の適応に関与脳幹ニューロン集団の同定に焦点を当てました。 2つのアプローチが、動物の生体内で関与する神経細胞集団を同定することが記載され、ex vivoでの求心路遮断脳幹準備インチインビボ 、動物は。高炭酸ガスまたは低酸素ガス混合物にさらされたex vivoで 、求心路遮断準備が低酸素や高炭酸ガス人工脳脊髄液で灌流しました。両方の場合において、いずれかの制御インビボ動物またはE でX vivoでの製剤は、正常酸素とnormocapnic条件下で維持しました。これら二つのアプローチの比較は、インビボにおいて 、末梢および/ または中枢ニューロンの活性化、すなわちの起源の決意を可能にし、 エクスビボ 、brainstemsを集め、固定し、切片にスライスしました。切片を調製した後、C-FOSタンパク質の免疫組織化学的検出は、低酸素または高炭酸ガス刺激によって活性化された細胞の脳幹のグループを識別するためになされました。標識された細胞は、脳幹の呼吸器の構造で計数しました。対照条件と比較して、低酸素症または高炭酸ガス血症は、c-FOSの数を増加させ、したがって、中央呼吸ドライブの適応に関与するニューロン経路の構成されているいくつかの特定の脳幹部位で細胞を標識しました。
Introduction
C-fosの遺伝子は、1980 1,2の初めに初めて同定し、その産物は、遺伝子活性化剤の特性3,4を有する核タンパク質として1984年に特徴づけられました。これは、ニューロンの刺激に関連した長期的なメカニズムに参加しています。実際に、ニューロンの活性の変化は、転写因子のc-FOSの産生を誘導する前初期遺伝子c-FOSの発現を誘導する二次メッセンジャーシグナル伝達カスケードにつながります。後者は、後期遺伝子の発現を開始し、したがって、刺激4多くの異なる種類の神経系の適応応答に関与しています。したがって、1980 5,6の端部から、C-FOSタンパク質の検出は、しばしば、ニューロン経路をマッピングするための一般的な4および中枢神経系（CNS）の活性に遺伝子転写の外因性因子の効果を研究するために使用されています異なる生理学的に関与アル条件。
基底のc-fosの発現は、マウス、ラット、ネコ、サル、およびヒトの4を含む様々な種において研究されています。これにより、その発現の動態は比較的よく知られています。転写活性化は、（5〜20分）7,8迅速であり、かつmRNA蓄積を刺激9の発症後30〜45分の間で最大に達し、12分の短い半減期で低下します。 C-FOSタンパク質合成は、mRNAの蓄積に続く、20〜90分後に刺激6で免疫組織化学によって検出することができました。
c-fosの発現の分析は、古典的低酸素症または高炭酸ガス10-14への換気応答に関与する中心的な呼吸ネットワークを識別するために、in vivo試験で使用されています。最近では、このツールはまた、低酸素症またはhに中央呼吸ネットワーク適応を探索するためにex vivoで脳幹の製剤で使用されましたypercapnia 15-18。確かに、これらの製剤は、古典的に中央呼吸ドライブ19に同化リズミカルな活動を生成します。従って、製剤のこのタイプは、完全に求心路遮断であるという利点を有し、従って、C-fosの発現についての結果は、周辺構造の介入なしに、中央の刺激の結果を反映します。
C-FOSの検出は、免疫組織化学的または免疫組織蛍光アプローチによって行うことができます。間接的な免疫は、c-FOSに対する一次抗体と一次抗体が産生された種に対して指向二次抗体の使用を必要とします。免疫組織化学法のために、二次抗体は、基質（ペルオキシダーゼH 2 O 2）に作用する酵素（例えばペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされています。酵素反応の生成物は、色原体（3.3ジアミノベンジジンtetrahydrochloridによって開発されていますE）、それを染色し、光学顕微鏡下で観察することができます。反応は、ニッケル硫酸アンモニウムを用いて強化することができます。これらの方法は、異なる生理学的な課題中の活性物質の神経細胞の検出、したがって、同定および/または連続した生理的応答に関与末梢および中枢経路のマッピングを可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
C-FOSの前初期遺伝子であり、その生成物の検出は、C-FOSタンパク質は、古典的なインビボ 11,13,25,28 内の特定の呼吸応答に関与する神経細胞集団を同定するために使用され、 エクスビボで 16-18、 27,32,33。
議定書の中で重要なステップ
灌流工程の間には注意してください。 4％PF…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Materials
| Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
| 15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
| primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
| (Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
| Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
| Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| Xylene | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
| Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
| BSA | Sigma | A2153 |
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