A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas<em> In Vivo</em> e<em> Ex Vivo</em

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Muitos estudos buscam identificar e mapear as regiões cerebrais envolvidas na regulamentação fisiológicas específicas. As c-fos proto-oncogene, um gene precoce imediato, é expresso em neurónios em resposta a vários estímulos. O produto proteico pode ser facilmente detectada com técnicas de imuno-histoquímica que levam à utilização de detecção de c-fos para mapear grupos de neurónios que exibem alterações na sua actividade. Neste artigo, nós nos concentramos na identificação de populações de tronco cerebral neuronal envolvidos na adaptação ventilatória à hipoxia ou hipercapnia. Duas abordagens foram descritas para identificar populações neuronais envolvidos in vivo em animais e ex vivo em preparações do tronco cerebral desaferentada. In vivo, os animais foram expostos a misturas de gases hipercápnicos ou hipóxicos. Ex vivo, preparações desaferentada foram superfused com hipóxica ou fluido cerebrospinal artificial hipercápnica. Em ambos os casos, tanto em animais de controlo in vivo ou ex preparações in vivo foram mantidas sob condições de normóxia e normocápnicos. A comparação destas duas abordagens permite a determinação da origem da activação neuronal ou seja, periférica e / ou central. In vivo e ex vivo, tronco cerebral foram recolhidas, fixadas e cortado em secções. Uma vez que as secções foram preparados, a detecção imuno-histoquímica da proteína de c-fos foi feito a fim de identificar os grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos de hipoxia ou hipercapnia. As células marcadas foram contadas em estruturas respiratórios no tronco cerebral. Em comparação com a condição de controle, hipoxia ou hipercapnia aumentou o número de c-fos células marcadas em vários locais do tronco cerebral específicas que são, portanto, constitutiva dos percursos neuronais envolvidas na adaptação do impulso respiratório central.

Introduction

O gene c-fos foi identificado pela primeira vez no início de 1980 ^{a 1,2} e o seu produto foi caracterizado em 1984 como uma proteína nuclear que tem propriedades do gene activador de ^3,4. Participa em mecanismos de longo prazo associados com estimulação neuronal. Com efeito, as mudanças na actividade neuronal levar ao segundo mensageiro cascatas de sinalização que induzem a expressão do gene precoce imediato c-fos, que induz a produção do factor de transcrição de c-fos. O último inicia a expressão de genes tardios e assim participa em respostas adaptativas do sistema nervoso para muitos tipos diferentes de estímulos ^4. Assim, desde o final de 1980 ^5,6, detecção de proteína c-Fos tem sido frequentemente utilizada para estudar os efeitos de factores externos sobre a transcrição de genes, em geral, e ⁴ sobre a actividade do sistema nervoso central (CNS) para o mapeamento de vias neuronais envolvido na fisiológico diferentecondições al.

A expressão de c-fos basal foi estudado em várias espécies, incluindo ratos, ratazana, gato, macaco, humano e ^4. Assim, a cinética da sua expressão é relativamente bem conhecidos. A activação da transcrição é rápida (5 a 20 min) ^7,8, e a acumulação de ARNm atinge um máximo entre 30 e 45 min após o início da estimulação ⁹ e diminui com um semi-vida curta de 12 minutos. A síntese de proteína c-Fos seguinte acumulação de ARNm e pode ser detectado por imuno-histoquímica em 20 a 90 min após a estimulação ^6.

Análise da expressão de c-fos é classicamente usado em estudos in vivo para identificar a rede respiratório central envolvida nas respostas ventilatórios a hipoxia ou hipercapnia ^10-14. Mais recentemente, esta ferramenta também foi usado em preparações do tronco cerebral ex vivo para explorar adaptações rede respiratórias centrais à hipoxia ou hypercapnia ^15-18. Com efeito, estas preparações gerar uma atividade rítmica classicamente assimilado ao comando central da respiração ^19. Assim, este tipo de preparação tem a vantagem de ser totalmente desaferentada, e, portanto, os resultados relativos a expressão de c-fos só refletem as consequências de uma estimulação central sem qualquer intervenção de estruturas periféricas.

A detecção de c-fos podem ser feitos por métodos de imuno-histoquímica ou immunohistofluorescence. imunodetecção indirecta que requer a utilização de um anticorpo primário contra o c-Fos e um anticorpo secundário dirigido contra as espécies em que foi produzido o anticorpo primário. Para o método de imuno-histoquímica, o anticorpo secundário é conjugado com uma enzima (peroxidase de, por exemplo) que actua sobre um substrato (H ₂ O ₂ para a peroxidase). O produto da reacção enzimática é desenvolvido por um cromogénio (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobenzidinae), que cora ele e pode ser observada através de microscopia óptica. A reacção pode ser reforçado usando sulfato de níquel de amónio. Estes métodos permitem a detecção de substâncias activas neurónios durante diferentes desafios fisiológicos e, por conseguinte, a identificação e / ou o mapeamento de vias periféricas e centrais envolvidos nas respostas fisiológicas consecutivos.

Protocol

Nota: A detecção de c-fos é um procedimento normalizado que envolve vários passos (Figura 1). Todas as experiências foram realizadas em ratos ou ratinhos. protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal Charles Darwin (CE5 / 2011/05), feito de acordo com a directiva de 22 de setembro de 2010 (2010/63 / UE) para o cuidado animal, Conselho das Comunidades Europeias e conduzida de acordo com as leis francesas para o cuidado animal. …

Representative Results

A detecção de c-fos é uma ferramenta útil que permite que os grupos de identificação de células activadas sob condições específicas, tais como a hipoxia e hipercapnia in vivo (Figura 2A) ou em situações que mimetizam estas condições ex vivo (Figura 2B). In vivo, o recém-nascido, jovem ou roedores adultos foram colocados numa caixa estanque ao ar, em que o meio gasoso é continuamente renovada por uma mistura gaso…

Discussion

C-fos é um gene precoce imediato, e a detecção do seu produto, a proteína c-Fos, é classicamente usado para identificar populações neuronais envolvidas em respostas respiratórias específicas in vivo e ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

Passos críticos dentro do protocolo

Tenha cuidado durante a etapa de perfusão. A solução PFA 4% deve ser bem preparado e os passos d…

Materials

Cell culture plate 12-Well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153