C-FOS Protein Immunohistological Detection: ett användbart verktyg som en markör centralbanks involverade i specifika fysiologiska reaktioner<em> In Vivo</em> och<em> Ex vivo</em

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Många studier försöka identifiera och kartlägga områden i hjärnan som är involverade i specifika fysiologiska regler. Proto-onkogenen c-fos, en omedelbar tidig gen, uttrycks i neuroner som svar på olika stimuli. Proteinprodukten kan lätt detekteras med immunohistokemiska tekniker som leder till användning av c-FOS upptäckt att kartlägga grupper av nervceller som visar förändringar i sin verksamhet. I den här artikeln har vi fokuserat på att identifiera hjärnstammen neuronala populationer är inblandade i andnings anpassning till hypoxi eller hyperkapni. Två tillvägagångssätt har beskrivits för att identifiera inblandade neuronpopulationer in vivo i djur och ex vivo i deafferenterad hjärnstams preparat. In vivo djur exponerades för hyperkapni eller hypoxiska gasblandningar. Ex vivo, var deafferenterad preparat superfuseras med hypoxisk eller hyperkapni artificiell cerebrospinalvätska. I båda fallen, antingen kontroll in vivo djur eller ex vivo preparat hölls under normoxiska och normocapnic förhållanden. Jämförelsen mellan dessa två tillvägagångssätt möjliggör fastställandet av ursprung neuronala aktiverings dvs perifera och / eller centrala. In vivo och ex vivo har brainstems samlas in, fast, och skivade i sektioner. När sektionerna preparerades ades immunhistokemisk detektion av c-fos-protein som gjorts i syfte att identifiera de hjärnstammen grupper av celler som aktiveras av hypoxiska eller hyperkapni stimuleringar. Märkta celler räknades i hjärnstamsandnings strukturer. I jämförelse med kontroll tillstånd, hypoxi eller hyperkapni ökade antalet C-FOS märkta celler i flera specifika hjärnstams webbplatser som således konstitutiv av de nervbanor som är involverade i anpassningen av den centrala andningsdrift.

Introduction

C-fos-genen identifierades för första gången i början av 1980 ^1,2 och dess produkt präglades 1984 som ett nukleärt protein som har gen-aktivator egenskaper ^3,4. Den deltar i långsiktiga mekanismer i samband med neuron stimulering. Faktiskt, förändringar i neuronal aktivitet leder till sekundära budbärarsystem signaleringskaskader som inducerar uttrycket av de omedelbara tidiga genen c-fos, vilket inducerar produktion av transkriptionsfaktorn c-fos. Den senare initierar uttryck av sena gener och därmed deltar i adaptiva svar i nervsystemet till många olika typer av stimuli ^4. Således, sedan slutet av 1980 ^5,6, c-fos-proteindetektion har ofta använts för att studera effekterna av exogena faktorer på gentranskription i allmänhet ⁴ och på aktiviteten hos det centrala nervsystemet (CNS) för att kartlägga nervbanorna involverade i olika fysiologiskaal villkor.

Basal c-fos-uttryck har studerats i olika arter, inklusive möss, råtta, katt, apa och människa ^4. Därigenom, kinetiken för dess uttryck är relativt väl känd. Transkriptionsaktivering är snabb (5-20 min) ^7,8, och mRNA ackumuleringen når ett maximum mellan 30 och 45 min efter starten av stimuleringen ⁹ och avtar med en kort halveringstid på 12 minuter. C-fos-proteinsyntes följer mRNA-ackumulering och kunde detekteras genom immunhistokemi vid 20 till 90 min post-stimulering ^6.

Analys av c-fos-uttryck är klassiskt används i in vivo-studier för att identifiera central andnings nätverk som deltar i ventilatoriska svar på hypoxi eller hyperkapni ^10-14. På senare tid har det här verktyget används också i ex vivo hjärnstams förberedelser för att utforska centrala andningsnätverks anpassningar till hypoxi eller hypercapnia ^15-18. Faktum är att dessa preparat genererar en rytmisk aktivitet klassiskt likställas med den centrala andningsdrift ^19. Således, denna typ av preparat har fördelen av att vara helt deafferenterad och därför resultaten beträffande c-fos-uttryck endast återspegla konsekvenserna av en central stimulering utan något ingripande av perifera strukturer.

C-FOS detektion kan göras genom immunohistokemiska eller immunohistofluorescence metoder. Indirekt immundetektering nödvändiggör användningen av en primär antikropp mot c-fos och en sekundär antikropp riktad mot den art hos vilken den primära antikroppen producerades. För immunohistokemisk metod, är den sekundära antikroppen konjugerad med ett enzym (peroxidas, till exempel) som verkar på ett substrat _{(H2O 2} för peroxidas). Produkten av den enzymatiska reaktionen är utvecklad av en kromogen (3,3-diaminobensidin tetrahydrochloride), som färgar det och kan observeras under ljusmikroskop. Reaktionen kan förstärkas med hjälp av nickel ammoniumsulfat. Dessa metoder gör det möjligt för detektering av aktiva nervceller under olika fysiologiska utmaningar och därför identifiering och / eller kartläggning av perifera och centrala involverade i fysiologiska reaktioner i följd.

Protocol

Obs: c-FOS upptäckt är ett standardiserat förfarande som inbegriper flera steg (Figur 1). Alla experiment utfördes på råttor eller möss. Experimentella protokoll godkändes av den etiska kommittén i djurförsök Charles Darwin (CE5 / 2011/05), sker i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv av den 22 september, 2010 (2010/63 / EU) för djurvård, och genomförs i enlighet med franska lagar för djurvård. 1. Beredning av lösningar Förbereda 0,2 M …

Representative Results

C-FOS upptäckt är ett användbart verktyg som gör det möjligt att identifiera grupper av aktiverade celler under specifika förhållanden såsom hypoxi och hyperkapni in vivo (figur 2A) eller i situationer som efterliknar dessa villkor ex vivo (Figur 2B). In vivo, nyfödda, unga eller vuxna gnagare placerades i en lufttät låda i vilken den gasformiga miljön ständigt förnyas genom en gasblandning med en komposition exak…

Discussion

C-fos är en omedelbar tidig gen, och detekteringen av dess produkt, c-fos-protein, är klassiskt används för att identifiera neuronala populationer som är involverade i specifika respiratoriskt svar in vivo ^11,13,25,28 och ex vivo ^{16-18, 27,32,33.}

Kritiska steg inom protokollet

Var försiktig under perfusion steget. Den 4% PFA lösning måste vara väl förberedda och fixering…

Materials

Cell culture plate 12-Well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153