Zebrafisk som en model til at vurdere det teratogene potentiale af Nitrit

Summary

Udsættelse for teratogener kan forårsage fosterskader. Zebrafisk er nyttige til bestemmelse af teratogene potentiale af kemikalier. Vi demonstrerer anvendeligheden af ​​zebrafisk ved at udsætte embryoner til forskellige niveauer af nitrit og også på forskellige tidspunkter af eksponering. Vi viser, at nitrit kan være giftige og forårsage alvorlige udviklingsmæssige defekter.

Abstract

Høje nitratindhold i miljøet kan medføre medfødte defekter eller aborter hos mennesker. Formentlig dette skyldes omdannelsen af ​​nitrat til nitrit af tarm og spyt-bakterier. Men i andre mammale undersøgelser, høj nitritværdier ikke forårsager fødselsdefekter, selv om de kan føre til dårlige reproduktive resultater. Således er den teratogene potentiale af nitrit er ikke klart. Det ville være nyttigt at have et hvirveldyr modelsystem til nemt at vurdere teratogene virkninger af nitrit eller andre kemiske af interesse. Her demonstrerer vi nytten af zebrafisk (Danio rerio) til at screene forbindelser til toksicitet og embryonale defekter. Zebrafisk embryoner befrugtet eksternt og har hurtig udvikling, hvilket gør dem en god model for teratogene undersøgelser. Vi viser, at forøgelse af eksponeringstiden til nitrit negativt påvirker overlevelse. Øge koncentrationen af ​​nitrit også negativt påvirker overlevelse, mens nitrat ikke. For embryoner that overleve nitrit eksponering kan forskellige defekter forekomme, herunder perikardiel og blommesæk ødem, svømme blære noninflation, og kraniofaciale misdannelser. Vores resultater indikerer, at zebrafisk er en bekvem til undersøgelse teratogene potentiale af nitrit. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til at teste andre kemikalier for deres virkninger på tidlig hvirveldyr udvikling.

Introduction

Teratogenese er en proces, der forstyrrer den normale udvikling af et foster ved at forårsage permanente strukturelle og funktionelle abnormiteter, væksthæmning eller abort i svære tilfælde ^1. Det kan være forårsaget af visse naturlige midler (teratogener), som interfererer med fosterudviklingen på flere måder ^2. Under menneskelig fosterudvikling, har fælles teratogener såsom stråling, smitstoffer, giftige metaller og organiske kemikalier blevet rapporteret at forårsage defekter i epicanthic folder (fold huden i den øverste øjenlåg) og clinodactyly (buede finger eller tå) gennem morfogenetiske fejl ^1.

Forståelse af molekylære mekanisme for teratogenese er det første skridt i retning af at udvikle behandling og forebyggelse. Adskillige hvirveldyr modeller som Xenopus laevis (Xenopus laevis) og zebrafisk (Danio rerio) er blevet anvendt til at bestemme de molekylære veje ramt af teratogens. Tidligere undersøgelser har brugt zebrafisk som model for epidemiologi, toksikologi og teratogenese ^3-7. Scholz et al. betragtes zebrafisk som en "gold standard" for toksicitet miljøvurdering. Dette skyldes til dels, at gennemsigtigheden af zebrafisk embryo, som gør det muligt for forskerne at visualisere den udviklingsmæssige defekt som det forekommer ^8. Ca. 70% af menneskelige gener har orthologer i zebrafisk, hvilket gør zebrafisk en ønskelig hvirveldyr model til at studere menneskelige fejl ^9.

Nogle epidemiologiske studier har antydet, at nitrat og nitrit, almindeligvis til stede i gården fødevarer og vand, der er forbundet med fødselsdefekter eller spontane aborter ^10,11, mens andre undersøgelser ikke støtter denne forening ^12. Nitrat _(NO3 ^-) og nitrit _(NO 2 ^-) er naturligt til stede i jord og vand. De er en kilde til nitrogen til planter og er en del af nitrogen cyklus ^13. Fødevarer såsom grønne bønner, gulerødder, squash, spinat og roer fra gårde, der bruger gødning højt nitrat har væsentligt forøget indhold af nitrat og nitrit ^7. Mælk fra køer fodret med høje nitrat fødevarer og fisk i høj nitrat vand (primært fra jord afstrømning ³⁰⁾ kan føre til mennesker indtager store mængder af nitrat og nitrit ^14. Nitrat og nitrit er også almindeligt anvendt i fødevarer konservering, som dramatisk øger mængden indtages af mennesker ^12.

Optimale niveauer af nitrat og nitrit spille fundamentale roller i fysiologiske processer som vaskulær homeostase og funktion, neurotransmission og immunologiske vært forsvarsmekanismer ^13-15. Eksponering for høje niveauer af nitrat og nitrit, kan imidlertid føre til bivirkninger, især hos spædbørn og børn ^16. Indtages nitrat omdannes yderligere til nitrit i mundhulen ved mikroflora og i the mavetarmkanalen ved intestinal mikroflora ^17.

Nitrat sætter spædbørn på en høj risiko for blå baby syndrom ved oxidation af hæmoglobin til methæmoglobin, forringe hæmoglobin fra sin ilt transporterer evne ^18. Dette resulterer i den blå farve af huden, der strækker sig til perifere væv i mere alvorlige tilfælde. Hæmmet iltning af væv resultater i andre symptomer, hårdest fører til koma og død ^19,20. Lignende symptomer er observeret hos spædbørn og voksne ved højere koncentrationer af nitrat ^21. Forhøjede niveauer af methæmoglobin i voksne på grund af nitrit forgiftning medfører cyanose, hovedpine, åndedrætsbesvær ^31, og død, hvis de ikke behandles på grund af komplikationer i forbindelse med vitale vævshypoksi ^32,33.

Nitrat indtages på højere niveauer kan også resultere i forskellige sundhedsmæssige komplikationer. Barndom diabetes, tilbagevendende diarré og tilbagevendende luftvejsinfektioneri børn er blevet forbundet med høj nitrat indtag ^11,17,22. Kronisk eksponering for et højt niveau af nitrat er forbundet med vandladning og milt hemorrhaging. Akut høj dosis eksponering for nitrat kan føre til et bredt spektrum af medicinske tilstande som mavesmerter, muskelsvaghed, blod i afføring og urin, besvimelse og død ^11. Prænatal eksponering for nitrat ved høje niveauer har været forbundet med neurale rør og bevægeapparatet defekt ^11.

En nylig rapport viste, at behandling af zebrafisk embryoner med nitrit førte til blommesæk ødem, kraniofaciale og aksiale misdannelser, og svømme blære noninflation ^5. I denne undersøgelse udviser vi en fremgangsmåde til behandling zebrafisk embryoner med nitrat og nitrit at bestemme deres teratogent potentiale. Embryoner blev udsat for nitrit ved forskellige koncentrationer og forskellig varighed. Ethanol blev anvendt som en positiv kontrol, da det er en etableret teratogen ^23. Our metode viste, at både høje koncentrationer og lange eksponeringstider til nitrit var skadelige for overlevelse og resulteret i forskellige fænotyper, der spænder fra mild (ødem) til alvorlige (brutto udviklingsmæssige defekter). Derfor er zebrafisk er en nyttig model for direkte at udforske de potentielle teratogene virkninger af nitrat og nitrit på embryoner til at supplere epidemiologiske undersøgelser.

Protocol

De er beskrevet i denne protokol procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved Indiana University of Pennsylvania. 1. Harvest Embryoner Oprethold zebrafisk ved 28,5 ° C, pH 7, ledningsevne mellem 500-1,500 uS, og en lys / mørke cyklus på 14 timers lys og 10 timers mørke 24. Brug vildtypestammer såsom TU AB eller Tü / AB hybrid. Forskellige stammer kan reagere forskelligt på kemisk behandling 25. Opsætning af fisk t…

Representative Results

Udsættelse for 300 mM ethanol i 22 timer havde ingen effekt på overlevelse (data ikke vist), i overensstemmelse med tidligere rapporter 5,23,26. Dette er forventet, da ethanol er en kendt teratogen og tjente som en positiv kontrol. Observerede fænotyper inkluderet perikardiel ødem, svømmeblære noninflation (figur 1), kraniofaciale defekter, og forsinket udvikling (data ikke vist). Behandling m…

Discussion

Den her beskrevne metode viser anvendeligheden af ​​zebrafisk i vurderingen af ​​teratogene potentiale af nitrit og nitrat. Sammenlignet med andre hvirveldyr, zebrafisk har fordele, der omfatter høj frugtbarhed, ekstern befrugtning, optisk transparens, og hurtig udvikling. Ledige mutanter der mangler pigmentering (såsom casper zebrafisk ³⁶⁾ også bidrage til at øge synligheden af indre organer. Det er også nemt at generere transgene zebrafisk med reportergener at lette analysen i levende fisk <sup…

Materials

DREL/2010 instrument	Hach	26700-03
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX glass Petri Dish	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent	Hach	14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent	Hach	14065-99
Parafilm	Fisher Scientific	3-374-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
S6E stereomicroscope	Leica	10446294
Sodium nitrate	Fisher Scientific	S343
Sodium nitrite	Fisher Scientific	S347
Transfer pipets	Laboratory Products Sales	L320072
Glass vials	Fisher Scientific	03-338B