Sebrafisk som modell for å vurdere teratogene potensiale Nitritt

Summary

Eksponering for teratogens kan forårsake fødselsskader. Sebrafisk er nyttige for bestemmelse av teratogene potensialet av kjemikalier. Vi demonstrerer nytten av sebrafisk ved å utsette befruktede egg til ulike nivåer av nitritt og også på forskjellige tider av eksponering. Vi viser at nitritt kan være giftige og forårsake alvorlige utviklingsdefekter.

Abstract

Høye nitratnivåene i miljøet kan føre til medfødte defekter eller spontanaborter hos mennesker. Antagelig er dette på grunn av konvertering av nitrat til nitritt ved gut og spytt bakterier. Men i andre pattedyrstudier, høy nitritt nivåer ikke forårsake fødselsskader, selv om de kan føre til dårlig reproduktive utfall. Således er det teratogene nitrite ikke klart. Det ville være nyttig å ha et virveldyr modellsystem for enkelt å vurdere teratogene virkninger av nitritt eller ethvert annet kjemisk av interesse. Her viser vi nytten av sebrafisk (Danio rerio) å screene forbindelser for giftighet og embryonale defekter. Sebrafisk embryoer befruktet eksternt og har rask utvikling, noe som gjør dem en god modell for teratogene studier. Vi viser at ved å øke eksponeringstiden til nitritt negativt påvirker overlevelse. Økning av konsentrasjonen av nitritt også negativt påvirker overlevelse, mens nitrat ikke. For embryoer that overleve nitritt eksponering, kan ulike defekter oppstår, herunder perikard og plommesekken ødem, svømme blære noninflation, og kraniofaciale misdannelser. Våre resultater tyder på at sebrafisk er et praktisk system for å studere teratogene nitrite. Denne fremgangsmåten kan lett tilpasses for å teste andre kjemikalier for deres effekt på tidlige utviklings virveldyr.

Introduction

Misdannelser er en prosess som forstyrrer den normale utviklingen av et embryo eller foster ved å forårsake permanente strukturelle og funksjonelle avvik, veksthemming eller abort i alvorlige tilfeller ^1. Det kan være forårsaket av visse naturlige stoffer (teratogens), som interfererer med embryoutvikling på flere måter ^2. Under menneskelig fosterutvikling, har felles teratogens eksempel stråling, smittestoffer, giftige metaller og organiske kjemikalier blitt rapportert å forårsake defekter i epicanthic folder (hudfolden i øvre øyelokket) og clinodactyly (buet finger eller tå) gjennom morfogenetiske feil ^1.

Forstå den molekylære mekanismen for misdannelser er første skritt mot å utvikle behandling og forebygging. Flere virveldyr modeller som den afrikanske klorte frog (Xenopus laevis) og sebrafisk (Danio rerio) har blitt brukt til å bestemme molekylære stier berørt av teratogens. Tidligere studier har brukt sebrafisk som modell for epidemiologi, toksikologi og misdannelser ^3-7. Scholz et al. betraktet sebrafisk som en "gullstandard" for miljøtoksisitet vurdering. Dette skyldes delvis til gjennomsiktigheten av sebrafisk embryo, som tillater forskere å visualisere utviklingsdefekt som det skjer ^åtte. Omtrent 70% av menneskets gener har orthologues i sebrafisk, noe som gjør sebrafisk en ønskelig virveldyr modell for å studere menneskelige feil ^9.

Noen epidemiologiske studier har antydet at nitrat og nitritt, ofte til stede i gården mat og vann, er assosiert med misdannelser eller spontanaborter ^10,11, mens andre studier ikke støtter denne foreningen ^12. Nitrat (NO ₃ ^-) og nitritt (NO ₂ ^-) er naturlig tilstede i jord og vann. De er en kilde til nitrogen for planter, og er en del av de nitrogen syklus ^13. Matvarer som grønne bønner, gulrøtter, squash, spinat og rødbeter fra gårder som bruker gjødsel med høyt nitrat har betydelig utvidet nivåer av nitrat og nitritt ^7. Melk fra kyr matet med høye nitrat mat og fisk i høy nitrat vann (hovedsakelig fra jordavrenning ³⁰⁾ kan føre til mennesker forbruker store mengder nitrat og nitritt ^14. Nitrat og nitritt er også ofte brukt i konservering av mat, noe som dramatisk øker mengden inntas av mennesker ^12.

Optimale nivåer av nitrat og nitritt spille grunnleggende roller i fysiologiske prosesser som vaskulær homeostase og funksjon, neurotransmission og immunologiske vert forsvarsmekanismer ^13-15. Imidlertid kan utsettes for høye nivåer av nitrat og nitritt føre til uheldige virkninger, spesielt hos spedbarn og barn ^16. Inge nitrat er videre omdannes til nitritt i munnhulen ved mikrofloraen og i the mage-tarmkanalen av tarmfloraen ^17.

Nitrat setter spedbarn på en høy risiko for blå baby syndrom ved oksidasjon av hemoglobin til methemoglobin, svekke hemoglobin fra sin oksygenbærende evne ^18. Dette resulterer i den blå fargen på huden som strekker seg til perifert vev i mer alvorlige tilfeller. Hemmet oksygenering av vev resulterer i andre symptomer, mest alvorlig fører til koma og død ^19,20. Lignende symptomer er observert hos spedbarn og voksne ved høyere konsentrasjoner av nitrat ^21. Forhøyede nivåer av methemoglobin hos voksne på grunn av nitritt forgiftning resultater i cyanose, hodepine, pusteforstyrrelser ^31, og død hvis den ikke behandles på grunn av komplikasjoner knyttet til vitale vevshypoksi ^32,33.

Nitrat inge på høyere nivåer kan også resultere i ulike helse komplikasjoner. Barndom diabetes, tilbakevendende diaré, og tilbakevendende luftveisinfeksjonerhos barn har blitt koblet med høy nitrat inntak ^11,17,22. Kronisk eksponering for en høy grad av nitrat er forbundet med vannlating og milt blødning. Akutt høy dose eksponering for nitrater kan føre til et bredt spekter av medisinske tilstander som magesmerter, muskelsvakhet, blod i avføring og urin, besvimelse og død ^11. Prenatal eksponering til nitrat ved høye nivåer blitt forbundet med nevrale rør og muskelskjelett defekt ^11.

En fersk rapport viser at behandling av sebrafisk embryoer med nitritt førte til plommesekken ødem, kraniofaciale og aksiale misdannelser, og svømme blære noninflation ^5. I denne studien viser vi en fremgangsmåte for behandling av sebrafisk embryoer med nitrat og nitritt for å bestemme deres potensiale teratogene. Embryoer ble utsatt for nitritt ved forskjellige konsentrasjoner og forskjellige lengder av tid. Etanol ble benyttet som en positiv kontroll, siden det er et etablert teratogen ^23. Our metoden viste at både høye konsentrasjoner og lange eksponeringstider til nitritt var skadelig for overlevelse og resultert i ulike fenotyper, alt fra mild (ødem) til alvorlige (brutto utviklingsmessige defekter). Derfor sebrafisk er en nyttig modell for direkte å utforske de potensielle teratogene effekter av nitrat og nitritt på befruktede egg for å utfylle epidemiologiske studier.

Protocol

Prosedyren som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Indiana University of Pennsylvania. 1. Harvests Embryoet Oppretthold sebrafisk på 28,5 ° C, pH 7, ledningsevne mellom 500-1,500 iS, og en lys / mørke syklus på 14 timer lys og 10 timer mørke 24. Bruk villtype-stammer som Tü, AB eller Tü / AB hybrid. Ulike stammer kan reagere forskjellig på kjemisk behandling 25. Sett opp fisken for p…

Representative Results

Eksponering til 300 mM etanol i 22 timer hadde ingen virkning på overlevelsen (data ikke vist), i samsvar med tidligere rapporter 5,23,26. Dette er forventet, som etanol er en kjent teratogen og tjente som en positiv kontroll. Observerte fenotyper inkludert perikard ødem, svømmeblæren noninflation (figur 1), kraniofaciale defekter, og forsinket utvikling (data ikke vist). Behandling med nitritt …

Discussion

Metoden er beskrevet her demonstrerer nytten av sebrafisk i vurderingen av teratogene potensialet av nitritt og nitrat. Sammenlignet med andre virveldyr, sebrafisk har fordeler som inkluderer høy fruktbarhet, ytre befruktning, optisk gjennomsiktighet, og rask utvikling. Tilgjengelige mutanter som mangler pigmentering (for eksempel Casper sebrafisk ³⁶⁾ også bidra til å forbedre synligheten av indre organer. Det er også lett å generere transgen sebrafisk med reporter gener for å forenkle analysen i levend…

Materials

DREL/2010 instrument	Hach	26700-03
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX glass Petri Dish	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 Nitrate Reagent	Hach	14034-46
NitriVer 3 Nitrite Reagent	Hach	14065-99
Parafilm	Fisher Scientific	3-374-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
S6E stereomicroscope	Leica	10446294
Sodium nitrate	Fisher Scientific	S343
Sodium nitrite	Fisher Scientific	S347
Transfer pipets	Laboratory Products Sales	L320072
Glass vials	Fisher Scientific	03-338B