We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
knockdowns בתיווך RNA נמצא בשימוש נרחב לשלוט ביטוי גנים. המשפחה צדדי זה של טכניקות עושה שימוש RNA קצר (Srna) כי יכול להיות מסונתז עם כל רצף שנועדו להשלים כל הגן ממוקד עבור השתקה. בגלל Srna בונה יכולה להיות מוצגת בפני סוגי תאים רבים ישירות או באמצעות מגוון של וקטורים, ביטוי גנים יכול להיות מודחק בתאים חיים ללא הנדסה גנטית מייגעת. הטכנולוגיה הנפוצה ביותר RNA מציאה, התערבות RNA (RNAi), עושה שימוש מושרה RNA אנדוגני השתקה מורכב (RISC) לתווך רצף הכרת המחשוף של mRNA היעד. יישומים של הטכניקה הזו ולכן מוגבלים RISC להביע אורגניזמים, אאוקריוטים בעיקר. לאחרונה, דור חדש של biotechnologists RNA פתח מנגנונים חלופיים לשליטת ביטוי גנים באמצעות RNA, וכך מתאפשר knockdowns גן בתיווך RNA בחיידקים. כאן אנו מתארים שיטה להשתקת הבעת גןשיאון ב E. coli מבחינה תיפקודית דומה RNAi. במערכת זו יש phagemid סינתטי נועד להביע Srna, אשר עשוי שנועד למקד כל רצף. בונת הביטוי מועברת לאוכלוסייה של E. קולי תאים עם הפאג M13 לא אלים, שלאחריו הוא מסוגל לשכפל כמו פלסמיד ביציבות. הכרה והשתקה אנטיסנס של mRNA היעד מתווכת על ידי חלבון Hfq, אנדוגני E. coli. פרוטוקול זה כולל שיטות לעיצוב antisense Srna, בניית וקטור phagemid, אריזת phagemid לתוך bacteriophage M13, הכנת האוכלוסייה תא חי עבור זיהום, וביצוע הזיהום עצמו. חלבון פלואורסצנטי mKate2 ואת acetyltransferase chloramphenicol גן עמידות לאנטיביוטיקה (CAT) ממוקדות להפיק נתונים נציג לכמת האפקטיביות מציאה.
knockdowns הגן בתיווך RNA להמשיך בשני שלבים. ראשית, מולקולת רנ"א הוא הציג קו תא או אורגניזם של המחקר. שנית, חלבונים קושרי RNA אנדוגני להקל הכרה RNA-היעד ולייצר אפקט השתקה. כל טכנולוגיות מציאת RNA ליהנות מן הטבע להתאמה האישי של sRNAs הסינטטי, אשר ניתן להפיק בקלות כדי להתאים למטרה ספציפית של עניין. עם זאת, את הפרטים המולקולריים של ספיגת RNA והשתקה להשתנות משמעותי על פני מערכת מודל, מגבילים איפה ואיך knockdowns RNA יכול להיות מיושם.
נמטודות, RNA פעמיים תקועים (dsRNA) מולקולות יכול להיות מוצג באופן ישיר בתקשורת או על ידי האכלה תולעים עם אוכלוסייה של dsRNA להביע E. 1,2 קולי תאים. תסיסנית, RNAi יכול להיות מושגת על ידי microinjecting עוברים עם dsRNA 3, או מיושם שורות תאים פשוט על ידי הוספת dsRNA עד בינוני התרבות 4. בשורות תאי יונקים,RNAs התערבות קטנה סינתטי (siRNAs) עשויה להיות מועברת לתאים חיים על ידי electroporation 1,2,5, ארוזים ליפוזומים 3,6, או לידי ביטוי מתוך וקטורים פלסמיד דנ"א 4,7. לאחר מינים RNA מגיע cytosol, מסלול RNAi מסתמך על מורכבות RISC לעבד dsRNA, להקל הכרה antisense של היעד, ולזרז את דיכוי translational, השפלה mRNA, או היווצרות heterochromatin, תלוי המארח.
בגלל דרישות אלה, קלסי RNAi יכול להתבצע רק באורגניזמים כי תופסי RNA אקסוגניים ביעילות ולהביע RISC או פעילות RISC דמוית. יש לציין, זו אינה כוללת את חיידק מודל E. coli, אשר חסרה את מסלול RNAi. עם זאת, התקדמות ביולוגיה סינטתית לספק את הכלים לפתור גם את בעית המשלוח ובעית ההשתקה.
בפרוטוקול זה, בונה Srna באים לידי ביטוי E. coli מן וקטור DNA נמסר liוינג התאים באמצעות מערכת phagemid / עוזר M13. Phagemid הוא כל פלסמיד עם ממוצא F1 הנגזרות הפאג של שכפול. פלסמיד עוזר, במקרה זה M13KO, נושאת את כל המנגנון הנדרש כדי לייצר חלקיקים נגיפיים, אך היא עצמה אינה מוסמכת לשכפול ואריזה. כאשר phagemid ו פלסמיד עוזר משתפים טרנספורמציה, phagemid לבד משוכפל בראשית הצירים F1, ארוז ומופרשת. Phagemid vectorized אז המוסמכות להדביק חי E. coli באמצעות pilus F.
במערכת זו, ההשפעה השתקה מופק על ידי קלטות מנהג Srna שילוב רצף פיגום עם רצף מחייב היעד. רצף מחייב היעד הוא 24 זוגות בסיסים antisense כדי יעד mRNA, בדרך כלל באתר מחייב הריבוזום (RBS). רצף הפיגום, שפותח על ידי Na ועמיתיו 8, מכיל מוטיב מחייב Hfq מופק MICC, RNA רגולטוריים קטן אנדוגני E. coli. החלבון Hfq מגרה RNA-RNA bindin g והשפלה mRNA, ממלאת את תפקידי במערכת זו דומה RISC ב RNAi. איור 1 מתאר תוכנית מלאה הנוקאוט Srna בתיווך הפאג, לרבות המבנה קלטת Srna, vectorization phagemid, ומנגנון השתקה.
כשיטה לווסת ביטוי גנים א השתקת coli, Srna היא פשוטה, מהירה צדדית. וממוקדי E. coli הוא לא עמוס מעבר להפצת phagemid ומבטא את Srna. זה עשוי להיות רלוונטי בהקשר של ביולוגיה סינתטית או מחקר בסיסי מה מקור הביטוי של מבנים Heterologous גדול יכול להתאמץ משאבים הסלולר 9. Phagemids עם מטרות חדשות יכול להיות מיוצר עם יחיד PCR וקצר יום אחד לאחר שינוי phagemid. לבסוף, כמעט כל mRNA יכול להיות ממוקד. הקלטת תקנת Srna (על פלסמיד סטנדרטי) הוכחה לעבוד על מגוון רחב של מטרות במטבוליזם עם רמות דיכוי טיפוסיות> 90% 8.
<p class = "jove_content"> פרוטוקול זה מתרבה ומרחיב על העבודה קודמת באמצעות phagemid יליד Srna קלטות 10. ראשית, phagemid ארוז הוא הציג את התרבות אצווה של E. קולי תאים והשתמשו להשתיק ביטוי של חלבון פלואורסצנטי mKate2. שינויי קרינה לאחר מנוטר בזמן אמת. שנית, דריסת גן CAT מוצג להפחית התנגדות chloramphenicol פנוטיפי על צלחות אגרו. בשני המקרים, phagemid עצמה נושאת סמן GFP, המאפשר שיעור זיהום להימדד באופן בלתי תלוי את יעילות מציאה.השיטה הנוכחית השיגה 80 הפחתת% ברמות קרינת mKate בהשוואה לקבוצת ביקורת לא ממוקדת. זו עולה בקנה אחד עם שיטות מציאה RNA אחרים, שבהם השתקה מוחלטת לא נצפו ויעילות 50-90% אופייני 16,17. ברמת פנוטיפי, knockdowns במיקוד CAT הצליח להחליש התנגדות chloramphenicol משמעותית, ולחסל אותו בתנאים מסוימים.
פנוטיפ המציאה לא הורגש ברמת האוכלוסייה רק לאחר כמה שעות לאחר הדבקה (איור 3 ב). זה ממחיש תכונה חשובה של משלוח מבוסס הפאג: תדר מציאה גבוה ניתן להשיג ישירות בתרבות תצווה ללא הנדסה גנטית מוקדמת. בניגוד שינויים גנטיים קונבנציונליים באמצעות טרנספורמציה פלסמיד או אינטגרציה הגנומי, זיהום הפאג אינו מחייב כי אוכלוסייה מחדש גדלה ממושבה אחת מבודדת. זה מאפשר את ההשפעות של זיהום הפאג להיות Explored באוכלוסיות עם דינמיקה מרחבית מורכבת 11, עם מבנים מרחביים קיימים כמו biofilms 18, או באוכלוסיות טבעיות מעורבות גנטי 19.
שלב קריטי שיטה זו הוא ייצור של phagemid ארוז ב כייל גבוה. נטל מטבוליות הקשורות ייצור החלקיקים הפאג עלול להוביל שיעור גבוה של מוטציה או הפסד פלסמיד ב זן הייצור phagemid. מומלץ כי זן ייצור phagemid להיות מתורבת ישירות ממושבת cotransformed יחידה ולא בקירור, קפוא או תת תרבות לפני הקציר הפאג. יעילות נמוכה של שינוי שיתוף יכול להיות גם ציין בעת השקת הפלסמיד phagemid ועוזרו כדי E. coli זמנית. במקרה זה, יעילות גבוהה יותר ניתן לקבל על ידי הפיכת פלסמיד עזר הראשונה, ולאחר מכן הכנת תאים מוסמכים הנושאת את הפלסמיד עוזר לטרנספורמציה הבא עם phagemid.
Phaזיהום gemid או ביטוי Srna גם מטיל עומס מטבולים לזיהוי על תאי המטרה, ועלול לגרום לכך שחלק הפרעות פנוטיפי. לדוגמא, צמצום קרינת mKate2 נצפה גם כאשר תאים נדבקו עם CAT מיקוד phagemid (איור 3). זיהום עם M13 ככל הנראה אינו לעורר תגובות לחץ מערכתיות ב E. 20 coli, אך הוא עשוי לשנות את דפוסי תעתיק בעקיפין. לחילופין, סמנים GFP או התנגדות אמפיצילין כלל על phagemid עשויים להתחרות על משאבים הסלולר, הפחתת mKate2 ביטוי וצמיחה 9. לבסוף, קלטת Srna עצמו עשויה גלובלי לשנות פרופילי ביטוי גנים על ידי titrating חלבון Hfq, או באמצעות השתקת mRNA מחוץ יעד. תופעות יעד כבויות נפוצות in vivo RNAi מיקוד 21-23, אבל הם עדיין צריכים להיחקר באופן שיטתי עבור מערכת זו.
מגבלה אחת של שיטה זו היא כי אפי זיהוםciency הוא פחות מ -100%, המאפשר כמה חיידקים שאינם נגועים להתמיד האוכלוסייה. את התוצאות של העבודה הזאת קודם לכן העבודה 10 מראים כי תאי noninfected לייצג 1-10% מהאוכלוסייה הסופי, וכן הם אחראים ביותר של פנוטיפים nonsilenced ציין. מגוון מסלולים-התנגדות M13 ידוע, עם אובדן מוטציוני להיות הנפוץ ביותר של ביטוי pilus 24. לאור המגבלות הללו, שולטים יש להשתמש כדי לאמת את שערי זיהום גבוהים ויעילות מציאה.
הגבלת פוטנציאל נוספת עבור יישומים מסוימים היא העברת המזדמנים של זיהום הפאג עוזר. למרות M13K07 מכיל אות אריזת מוטציה, זה יכול להיות ארוז לתוך קפסיד הפאג בתדירות נמוכה והועבר אוכלוסיות נגועות, וכתוצאה מכך תאים מוסמכים לייצור הפאג והתפשטות משך הפאג מעבר לאירוע הזיהום הראשוני 25. עשיית שינויים הפאג עוזר הוכיחו יעילותלצמצם אריזה ספציפית, אם כי לפעמים על חשבון ייצור הפאג מופחת 26.
בקטריופאג מהונדסים הפכו לכלי הכרחי עבור E. ביולוגיה סינתטית coli, המאפשר אספקה מהירה של גנים חדשים הגידול באוכלוסייה. מחקר שנערך לאחרונה הפיק מעגלים תקשורת בין תאית 11 או הביעו גורמי שעתוק לדכא עמידות לאנטיביוטיקה מסלולים 27. הפרוטוקול המובא כאן מוסיף אוסף גדל והולך של כלים המאפשרים שליטת פיזיולוגית חיידקים באמצעות RNAs המתוכנת. Nucleases CRISPR-קאש, כאשר מוטציה לחסל פעילות nuclease, הוכחו להדחיק שעתוק לעבר מטרות הגן מונחה RNA 17,28. לעומת זאת, השתקת Srna עובדת ברמת translational ואינה דורשת ביטוי חלבון אקסוגני. ביוטכנולוגיות הדור הבא עשויה להתאחד מלאת translational ו תעתיק עם משלוח בתיווך הפאג לתכנת pheno מורכבסוגים בזמן אמת.
The authors have nothing to disclose.
מימון עבור עבודה זו סופק על ידי Fondation בטנקור שולר בתמיכה של צוות פריז בטנקור iGEM. אנו מודים ביחידת המחקר U1001 INSERM ושנטל Lotton לקבלת סיוע טכני וייעוץ. Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP סופק על ידי מוניקה אורטיז דרו Endy של סטנפורד.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |