We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
आरएनए की मध्यस्थता knockdowns व्यापक रूप से जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। तकनीक के इस बहुमुखी परिवार लघु शाही सेना (sRNA) है कि किसी भी दृश्य के साथ संश्लेषित किया जा सकता है और किसी भी जीन मुंह बंद करने के लिए लक्षित पूरक बनाया का उपयोग करता है। sRNA constructs क्योंकि सीधे कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए पेश किया जा सकता है या वैक्टर की एक किस्म का उपयोग, जीन अभिव्यक्ति श्रमसाध्य आनुवंशिक संशोधन के बिना जीवित कोशिकाओं में दमित जा सकता है। सबसे आम आरएनए पछाड़ना प्रौद्योगिकी, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई), अंतर्जात आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल (RISC) मध्यस्थता करने के लिए अनुक्रम मान्यता और लक्ष्य mRNA की दरार का उपयोग करता है। इस तकनीक के आवेदन इसलिए RISC व्यक्त जीवों, मुख्य रूप से eukaryotes तक सीमित हैं। हाल ही में, आरएनए biotechnologists की एक नई पीढ़ी आरएनए के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए वैकल्पिक तंत्र विकसित किया है, और इतने बैक्टीरिया में संभव आरएनए की मध्यस्थता जीन knockdowns बनाया है। यहाँ हम जीन अभिव्यक्ति मुंह बंद करने के लिए एक विधि का वर्णनई में सायन कोलाई कार्यात्मक आरएनएआई कि जैसा दिखता है। इस प्रणाली में एक कृत्रिम phagemid sRNA है, जो किसी भी क्रम को लक्ष्य बनाया गया हो सकती है व्यक्त करने के लिए बनाया गया है। अभिव्यक्ति का निर्माण ई की आबादी के लिए दिया जाता है गैर-अपघट्य M13 फेज, जिसके बाद यह स्थिरतापूर्वक एक प्लाज्मिड के रूप में दोहराने के लिए सक्षम है के साथ कोलाई कोशिकाओं। Antisense मान्यता और लक्ष्य mRNA का मुंह बंद Hfq प्रोटीन, ई अंतर्जात द्वारा मध्यस्थता है कोलाई। इस प्रोटोकॉल, antisense sRNA डिजाइनिंग phagemid वेक्टर निर्माण, M13 जीवाणुभोजी में phagemid पैकेजिंग, संक्रमण के लिए एक जीवित सेल की आबादी की तैयारी कर रहा है, और संक्रमण में ही प्रदर्शन के लिए तरीके शामिल हैं। फ्लोरोसेंट प्रोटीन mKate2 और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन chloramphenicol acetyltransferase (कैट) के प्रतिनिधि डेटा उत्पन्न करने के लिए और पछाड़ना प्रभावशीलता यों को लक्षित कर रहे हैं।
आरएनए की मध्यस्थता जीन knockdowns दो चरणों में आगे बढ़ें। सबसे पहले, एक आरएनए अणु एक सेल लाइन या अध्ययन के जीव के लिए शुरू की है। दूसरा, अंतर्जात शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन शाही सेना लक्ष्य मान्यता की सुविधा और मुंह बंद प्रभाव पैदा करते हैं। सभी आरएनए पछाड़ना प्रौद्योगिकियों सिंथेटिक sRNAs का अनुकूलन प्रकृति है, जो आसानी से ब्याज की एक विशेष लक्ष्य के मैच के लिए उत्पादन किया जा सकता से लाभ। हालांकि, आरएनए तेज और मुंह बंद करने की आणविक विवरण व्यापक रूप से मॉडल प्रणाली के पार, बाधा कहाँ और कैसे आरएनए knockdowns लागू किया जा सकता बदलती हैं।
नेमाटोड में डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) अणुओं सीधे मीडिया में या dsRNA व्यक्त ई की आबादी के साथ कीड़े खिलाने से पेश किया जा सकता कोलाई कोशिकाओं 1,2। ड्रोसोफिला में, आरएनएआई बस संस्कृति के माध्यम से 4 dsRNA जोड़कर dsRNA 3 के साथ भ्रूण microinjecting के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, या सेल लाइनों में लागू किया है। स्तनधारी सेल लाइनों में,सिंथेटिक छोटे दखल RNAs (siRNAs) electroporation 1,2,5 द्वारा जीवित कोशिकाओं के लिए दिया जा सकता है, liposomes 3,6 में पैक, या डीएनए प्लाज्मिड वैक्टर 4,7 से व्यक्त किया। एक बार जब आरएनए प्रजातियों cytosol पहुंचता है, आरएनएआई मार्ग dsRNA प्रक्रिया है, लक्ष्य की antisense मान्यता की सुविधा है, और translational दमन, mRNA गिरावट, या हेट्रोक्रोमैटिन गठन को उत्प्रेरित, मेजबान के आधार पर करने के लिए RISC परिसर पर निर्भर करता है।
क्योंकि इन आवश्यकताओं की, शास्त्रीय आरएनएआई केवल जीवों कि कुशलतापूर्वक बहिर्जात आरएनए हाथ में ले लिया और RISC या एक RISC-तरह गतिविधि को व्यक्त करने में किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह शामिल नहीं मॉडल जीवाणु ई कोलाई, जो आरएनएआई मार्ग का अभाव है। हालांकि, सिंथेटिक जीव विज्ञान में हाल के अग्रिमों दोनों वितरण की समस्या और मुंह बंद करने से समस्या का समाधान करने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, sRNA निर्माणों ई में व्यक्त कर रहे एक डीएनए वेक्टर से कोलाई ली के लिए दियाM13 phagemid / सहायक प्रणाली का उपयोग कोशिकाओं ving। एक phagemid एक फेज व्युत्पन्न प्रतिकृति की F1 मूल के साथ किसी भी प्लाज्मिड है। एक सहायक प्लाज्मिड, इस मामले में M13KO, सभी मशीनरी वायरल कणों का निर्माण करने के लिए आवश्यक किया जाता है, लेकिन प्रतिकृति और पैकेजिंग के लिए सक्षम ही नहीं है। जब एक phagemid और सहायक प्लाज्मिड सह तब्दील कर रहे हैं, अकेले phagemid, F1 मूल में दोहराया पैक और स्रावित होता है। Vectorized phagemid रहते हैं तो ई संक्रमित करने के लिए सक्षम है एफ Pilus के माध्यम से कोलाई।
इस प्रणाली में, मुंह बंद प्रभाव लक्ष्य बाध्यकारी अनुक्रम के साथ एक पाड़ अनुक्रम के संयोजन कस्टम sRNA कैसेट द्वारा निर्मित है। लक्ष्य बाध्यकारी अनुक्रम एक mRNA लक्ष्य को antisense 24 आधार जोड़े, आम तौर पर राइबोसोम बाध्यकारी साइट (आरबीएस) पर है। पाड़ अनुक्रम, ना और उनके सहयोगियों ने 8 द्वारा विकसित की है, एक Hfq बाध्यकारी मूल भाव MICC, एक छोटी सी नियामक आरएनए ई अंतर्जात से निकाला शामिल कोलाई। Hfq प्रोटीन को उत्तेजित करता है आरएनए-आरएनए bindinजी और mRNA गिरावट, इस प्रणाली आरएनएआई में RISC के लिए इसी तरह की भूमिका में एक सेवारत। चित्रा 1 sRNA कैसेट संरचना, phagemid vectorization, और मुंह बंद तंत्र सहित फेज की मध्यस्थता sRNA knockdowns, के लिए एक पूरी योजना को दर्शाया गया है।
एक विधि के रूप में ई जीन अभिव्यक्ति मिलाना कोलाई, sRNA मुंह बंद करने, सरल, तेजी से और बहुमुखी है। लक्षित ई कोलाई phagemid प्रचार और sRNA व्यक्त परे बोझ नहीं है। यह सिंथेटिक जीव विज्ञान या बुनियादी अनुसंधान जहां बड़े heterologous निर्माणों की अभिव्यक्ति सेलुलर संसाधनों 9 तनाव कर सकते हैं के संदर्भ में प्रासंगिक हो सकता है। नए लक्ष्य के साथ Phagemids एक भी पीसीआर के साथ उत्पादन किया जा सकता है और phagemid परिवर्तन के बाद एक दिन काटा। अंत में, लगभग किसी भी mRNA को निशाना बनाया जा सकता है। SRNA विनियमन कैसेट (एक मानक प्लाज्मिड पर) ठेठ दमन स्तरों> 90% 8 के साथ चयापचय में लक्ष्यों की एक किस्म पर काम करने के लिए दिखाया गया है।
<p claएस एस = "jove_content"> इस प्रोटोकॉल reproduces और phagemid में जन्मे sRNA कैसेट 10 का उपयोग कर पहले काम पर फैलता है। सबसे पहले, एक पैक phagemid ई के एक बैच संस्कृति को पेश किया है कोलाई कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन mKate2 की अभिव्यक्ति को चुप करने के लिए इस्तेमाल किया। इसके बाद प्रतिदीप्ति परिवर्तन वास्तविक समय में निगरानी कर रहे हैं। दूसरा, कैट जीन नीचे दस्तक अगर प्लेटों पर प्ररूपी chloramphenicol प्रतिरोध को कम करने के लिए दिखाया गया है। दोनों ही मामलों में, phagemid खुद को अनुमति देने के लिए संक्रमण दर पछाड़ना दक्षता की स्वतंत्र रूप से मापा जाना एक GFP मार्कर किया जाता है।वर्तमान पद्धति अलक्षित नियंत्रण की तुलना में हासिल की mKate प्रतिदीप्ति के स्तर में 80% की कमी। यह अन्य आरएनए पछाड़ना तरीकों, जहां पूरा मुंह बंद नहीं मनाया जाता है और 50-90% दक्षता ठेठ 16,17 के साथ कतार में है। प्ररूपी स्तर पर, कैट-लक्षित knockdowns काफी chloramphenicol प्रतिरोध attenuate, और कुछ शर्तों के तहत इसे खत्म करने में सक्षम थे।
पछाड़ना phenotype के केवल कुछ ही घंटे के बाद संक्रमण (चित्रा 3 बी) के बाद आबादी के स्तर पर detectable था। इस फेज डिलीवरी का एक महत्वपूर्ण विशेषता दिखाता है: एक उच्च आवृत्ति पछाड़ना से पहले आनुवंशिक संशोधन के बिना बैच संस्कृति में सीधे प्राप्त किया जा सकता है। प्लाज्मिड परिवर्तन या जीनोमिक एकीकरण का उपयोग पारंपरिक आनुवंशिक संशोधन के विपरीत, फेज संक्रमण की आवश्यकता नहीं है कि आबादी एक अलग कॉलोनी से फिर से उगाया जा सकता है। इस फेज संक्रमण के प्रभाव एक्सप्लोरेशन होने की अनुमति देताजटिल स्थानिक गतिशीलता 11 के साथ आबादी में एड, biofilms 18, या आनुवंशिक रूप से मिश्रित प्राकृतिक आबादी 19 में की तरह पूर्व मौजूदा स्थानिक संरचनाओं के साथ।
इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम उच्च अनुमापांक में पैक phagemid का उत्पादन होता है। चयापचय फेज कण उत्पादन के साथ जुड़े बोझ उत्परिवर्तन या phagemid उत्पादन तनाव में प्लाज्मिड नुकसान की उच्च दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यह सिफारिश की है कि phagemid उत्पादन तनाव जमे हुए या फेज फसल से पहले उप-सुसंस्कृत एक भी cotransformed कॉलोनी से सीधे सुसंस्कृत हो और प्रशीतित नहीं। सह-परिवर्तन की एक कम क्षमता भी जब ई करने के लिए phagemid और सहायक प्लाज्मिड शुरू मनाया जा सकता है कोलाई एक साथ। इस मामले में, उच्च क्षमता पहले सहायक प्लाज्मिड बदलने, तो असर phagemid के साथ बाद में परिवर्तन के लिए सहायक प्लाज्मिड सक्षम कोशिकाओं की तैयारी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
Phagemid संक्रमण या sRNA अभिव्यक्ति भी लक्ष्य कोशिकाओं पर एक detectable चयापचय बोझ लगाता है, और कुछ प्ररूपी गड़बड़ी में हो सकता है। उदाहरण के लिए, mKate2 प्रतिदीप्ति में कमी भी मनाया गया जब कोशिकाओं को एक phagemid को निशाना कैट (चित्रा 3) से संक्रमित थे। M13 के साथ संक्रमण ई में प्रणालीगत तनाव प्रतिक्रियाओं को गति प्रदान करने के बारे में सोचा नहीं है कोलाई 20 है, लेकिन ट्रांसक्रिप्शनल पैटर्न परोक्ष रूप से बदल सकता है। वैकल्पिक रूप से, GFP या एम्पीसिलीन प्रतिरोध मार्कर phagemid पर शामिल सेलुलर संसाधनों के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं, mKate2 अभिव्यक्ति और विकास 9 को कम करने। अंत में, sRNA कैसेट में ही विश्व स्तर पर Hfq प्रोटीन titrating द्वारा जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल परिवर्तन, या बंद लक्ष्य mRNA मुंह बंद करने के माध्यम से कर सकते हैं। बंद लक्ष्य प्रभाव में विवो आरएनएआई को निशाना 21-23 में आम हैं, लेकिन वे अभी तक व्यवस्थित इस प्रणाली के लिए जांच की जानी है।
इस पद्धति की एक सीमा है कि संक्रमण effi हैciency कम से कम 100%, कुछ गैर-संक्रमित बैक्टीरिया की आबादी में जारी रहती करने की इजाजत दी है। यह काम और पहले काम 10 के परिणाम बताते हैं कि noninfected कोशिकाओं अंतिम जनसंख्या का 1-10% का प्रतिनिधित्व करते हैं, और मनाया nonsilenced phenotypes के अधिकांश के लिए जिम्मेदार हैं। M13-प्रतिरोध करने के लिए मार्गों की एक किस्म Pilus अभिव्यक्ति 24 की सबसे आम जा रहा mutational हानि के साथ जाना जाता है। इन सीमाओं के प्रकाश में, नियंत्रण उच्च संक्रमण दर और पछाड़ना दक्षता पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
कुछ अनुप्रयोगों के लिए एक अन्य संभावित सीमा सहायक फेज contaminating के कभार हस्तांतरण है। हालांकि M13K07 एक उत्परिवर्तित पैकेजिंग संकेत होता है, यह फेज उत्पादन और आरंभिक संक्रमण घटना 25 परे फेज के निरंतर प्रसार के लिए सक्षम कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप कम आवृत्ति पर फेज capsid में पैक किया जा सकता है और संक्रमित आबादी को हस्तांतरित। सहायक फेज के लिए संशोधन प्रभावी सिद्ध कर दिया हैकम फेज उत्पादन 26 की कीमत पर अविशिष्ट पैकेजिंग को कम करने, हालांकि कभी कभी।
इंजीनियर जीवाणुभोजी ई के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गए हैं कोलाई सिंथेटिक जीव विज्ञान, एक बढ़ती हुई जनसंख्या के लिए नए जीन की त्वरित डिलीवरी की इजाजत दी। हाल ही में काम कहनेवाला संचार सर्किट 11 उत्पादित या एंटीबायोटिक प्रतिरोध को दबाने के लिए प्रतिलेखन कारक व्यक्त 27 रास्ते है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपकरण है कि प्रोग्राम किया RNAs के माध्यम से जीवाणु शरीर क्रिया विज्ञान के नियंत्रण की अनुमति की बढ़ती संग्रह के लिए कहते हैं। CRISPR कैस न्युक्लिअसिज़, जब nuclease गतिविधि को समाप्त करने के उत्परिवर्तित, आरएनए निर्देशित जीन लक्ष्य 17,28 पर प्रतिलेखन को दबाने के लिए दिखाया गया है। इसके विपरीत, sRNA मुंह बंद translational स्तर पर काम करता है और exogenous प्रोटीन अभिव्यक्ति की आवश्यकता नहीं है। अगली पीढ़ी के जैव प्रौद्योगिकी जटिल pheno कार्यक्रम के लिए फेज की मध्यस्थता वितरण के साथ ट्रांसक्रिप्शनल और translational नियंत्रण को एकजुट कर सकते हैंवास्तविक समय में प्रकार के।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए अनुदान पेरिस Bettencourt iGEM टीम के समर्थन में Fondation Bettencourt Schueller द्वारा प्रदान किया गया। हम तकनीकी सहायता और सलाह के लिए INSERM U1001 रिसर्च यूनिट और Chantal Lotton धन्यवाद। Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP मोनिका Ortiz और स्टैनफोर्ड आकर्षित Endy द्वारा प्रदान किया गया।
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |