We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
RNA 매개 knockdowns 널리 유전자 발현을 제어하는 데 사용됩니다. 기술이 다용도 가족 어떤 순서로 합성 사일런 대상 모든 유전자를 보완하도록 설계 될 수 짧은 RNA (스르나)를 사용한다. 스르나 직접 여러 종류의 세포에 도입 또는 벡터의 다양한 사용하여 구축 될 수 있기 때문에, 유전자 발현은 유전자 조작 수고없이 살아있는 세포에서 억제 될 수있다. 가장 일반적인 RNA 녹다운 기술은 RNA 간섭 (RNAi), 표적 mRNA는 내인성 RNA 유도 복합체 (RISC)를 침묵 중재하는 시퀀스 인식 및 절단을 이용한다. 이 기술의 응용 프로그램은 따라서 RISC 발현 생물, 주로 진핵 생물로 제한됩니다. 최근 RNA의 생물 공학자의 새로운 세대는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어하기위한 다른 메커니즘을 개발 등 세균 가능한 RNA 매개 유전자 knockdowns했다. 여기에서 우리는 유전자 EXPRES을 침묵하는 방법을 설명합니다E.에서 시온 대장균 기능의 RNAi는 비슷하게. 이 시스템에서 합성 파지 미드는 어떤 순서를 대상으로 설계 할 수있다 스르나를 표현하기 위해 설계되었습니다. 식 구조는 E.의 인구에 전달된다 이 플라스미드로 안정적으로 복제 할 수있는 후 비 용균 M13 파지와 대장균 세포. 안티센스 인식 대상의 mRNA의 사일런 싱은 E. 내인성 Hfq 단백질에 의해 매개되고 대장균. 이 프로토콜은, 안티센스 스르나를 설계 파지 미드 벡터를 구성, M13 박테리오파지에 파지 미드 포장, 감염 살아있는 세포 집단을 준비하고, 감염 자체를 수행하기위한 방법을 포함한다. 형광 단백질 mKate2 및 항생제 내성 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제 (CAT)의 대표 데이터를 생성하고, 최저 효과를 정량화하는 타겟팅.
RNA 매개 유전자 knockdowns은 두 단계로 진행합니다. 우선, RNA 분자는 세포주 또는 연구 유기체에 도입된다. 둘째, 내인성 RNA 결합 단백질이 RNA 표적 인식을 촉진하고 침묵 효과를 생산하고 있습니다. 모든 RNA 녹다운 기술은 쉽게 관심의 특정 목표에 맞게 제조 할 수 합성 sRNAs의 사용자 정의 특성, 혜택을 누릴 수 있습니다. 그러나 RNA 흡수와 침묵의 분자 세부 사항은 어디에 어떻게 RNA의 knockdowns을 적용 할 수 구속, 모델 시스템에 걸쳐 매우 다양합니다.
선충에서 이중 가닥 RNA는 (dsRNA를) 분자는 미디어 또는 dsRNA를 발현 E.의 인구 벌레에게 먹이를 직접 도입 할 수있다 콜라이 세포 1,2-. 초파리는 RNAi를 단순히 배지 4의 dsRNA의 dsRNA를 첨가하여 3 배아 마이크로 인젝션에 의해 달성 또는 세포주에서 구현 될 수있다. 포유 동물 세포 라인에서,합성 작은 간섭 RNA는 (siRNA의)는 리포좀 -3,6- 패키지로 전기 1,2,5-하여 살아있는 세포로 전달 또는 DNA 플라스미드 벡터 -4,7-로부터 발현 될 수있다. RNA의 종 세포질에 도달하면, RNAi의 경로는 dsRNA를 처리 대상의 안티센스 인식을 용이하게하고, 호스트에 따라 번역 억제, mRNA의 분해 또는 이질 염색질 형성을 촉진하기 위해 RISC 복합체에 의존한다.
때문에 이러한 요구 사항, 고전의 RNAi는 효율적으로 외래 RNA를지고 RISC 또는 RISC와 같은 활동을 표현하는 유기체에서 수행 할 수 있습니다. 특히,이 모델 박테리아 E. 제외 RNAi의 경로 부족 대장균. 그러나, 합성 생물학의 최근 발전은 배달 문제와 침묵의 문제를 모두 해결하기 위해 도구를 제공합니다.
이 프로토콜에서, 스르나 구조는 E.로 표현된다 하는 DNA 벡터에서 대장균은 리튬에 전달M13 파지 미드 / 헬퍼 시스템을 이용하여 세포를 ving. 파지 미드 복제의 파지 유래 F1 원점 어떤 플라스미드이다. 헬퍼 플라스미드는이 경우 M13KO에서 바이러스 입자를 생산하는데 필요한 모든 장치를 운반하지만, 복제 및 패키징 능력 그 자체이다. 파지 미드 및 헬퍼 플라스미드를 공동 – 형질 전환되는 경우, 단독 파지 미드는 F1 복제 원점 포장 분비된다. 벡터화 파지 미드 라이브 E.을 감염 후 능력이 은 F pilus를 통해 대장균.
이 시스템에서, 침묵 효과는 표적 – 결합 서열과 골격 서열과 함께 정의 스르나 카세트에 의해 제조된다. 타깃 결합 서열은 일반적으로 리보좀 결합 부위 (RBS)에서 mRNA를 표적으로 안티센스 24 염기쌍이다. 나 동료 (8)에 의해 개발 된 발판 순서는, MICC, E.에 내생 작은 규제 RNA로부터 추출 된 Hfq 바인딩 모티브를 포함 대장균. Hfq 단백질은 RNA-RNA의 bindin 자극g 및 mRNA의 분해, RNAi의에서 RISC와 비슷한이 시스템의 역할을 제공. 그림 1은 스르나 카세트 구조, 파지 미드 벡터화, 그리고 침묵기구와 파지 매개 스르나의 knockdowns을위한 완전한 방식을 보여줍니다.
방법 으로서는 E.에서 유전자 발현을 조절하는 대장균, 스르나의 침묵은 간단하고 신속하고 다양합니다. 대상 E. 대장균은 파지 미드를 전파하고 스르나을 표현 이상 부담하지 않습니다. 이 큰 이종 구조의 발현이 세포 자원 9 변형 할 수 합성 생물학 또는 기초 연구의 맥락에서 관련 될 수있다. 새로운 목표와 파지 미드는 단일 PCR로 제조하고 파지 미드 변환 후 하루를 수확 할 수있다. 마지막으로, 거의 모든 mRNA를 타겟팅 할 수 있습니다. 스르나 조절 카세트 (표준 플라스미드)> 90 % 8 전형적인 억제 수준 대사 대상의 다양한 작업을하는 것으로 나타났다.
<p class = "jove_content은">이 프로토콜은 재생 및 파지 미드 태어난 스르나 10 카세트 사용하여 이전 작업에 확장합니다. 우선, 포장 파지 미드는 E.의 배치 배양에 도입 대장균 세포와 형광 단백질 mKate2의 발현을 침묵하는 데 사용됩니다. 이후 형광 변경 사항이 실시간으로 모니터링된다. 둘째, CAT 유전자를 쓰러 뜨린 것은 한천 플레이트에 표현형 클로람페니콜 저항을 줄이기 위해 표시됩니다. 두 경우 모두, 파지 미드 자체 감염률 독립적 최저 효율을 측정 할 수 있도록하는 GFP 마커를 운반한다.본 방법은, 불특정 대조군과 비교 mKate 형광 수준에서 80 % 감소를 달성했다. 이것은 완전한 침묵이 관찰되지 않고 50-90% 효율 16,17 전형적인 다른 RNA 넉다운 방법과 일치한다. 표현형 수준에서 CAT-대상 knockdowns 크게 클로람페니콜 저항을 약화, 일부 조건에서 그것을 제거 할 수 있었다.
최저 표현형은 몇 시간 동안 감염 후 (도 3b) 후에 집단 수준에서 검출되었다. 이 파지 기반 전달의 중요한 특징을 보여 높은 최저 주파수가 이전 유전자 변형없이 일괄 문화를 직접 얻을 수있다. 플라스미드 변환 또는 게놈 통합을 사용하여 기존의 유전자 변형과는 달리, 파지 감염 인구가 하나의 고립 된 식민지에서 다시 재배 할 필요가 없습니다. 이 파지 감염의 효과 EXPLOR 수 있도록18, 또는 유 전적으로 혼합 된 자연 인구 19 생물막 같은 기존의 공간 구조와 복잡한 공간 역학 (11)와 인구 에디션.
이 방법에서 중요한 단계 높은 역가의 포장 파지 미드의 생산이다. 파지 입자 생산과 관련된 대사 부담은 파지 미드 생산 균주의 돌연변이 나 플라스미드 손실의 높은 속도로 이어질 수 있습니다. 파지 미드 생산 균주는 단일 cotransformed 식민지에서 직접 배양 및 냉장하지, 냉동 또는 파지 수확하기 전에 서브 배양하는 것이 좋습니다. E.에 파지 미드 및 도우미 플라스미드를 도입 할 때 공동 변환의 낮은 효율을 관찰 할 수있다 동시에 대장균. 이 경우, 더 높은 효율성은, 제 헬퍼 플라스미드를 변형 파지 미드 후속 변환을위한 헬퍼 플라스미드 베어링 적격 세포를 제조함으로써 얻을 수있다.
PHAgemid 감염 스르나 발현은 표적 세포에 대한 검출 가능한 대사성 부담을 부과 일부 표현형 교란을 초래할 수있다. 세포는 파지 미드 타겟팅 CAT (도 3)에 감염되었을 때, 예를 들어, 형광 mKate2의 저하도 관찰되었다. M13 감염은 E.의 전신 스트레스 반응을 유발하는 것으로 생각되지 않는다 대장균 20 만 간접적으로 전사 패턴을 바꿀 수 있습니다. 대안 적으로, 파지 미드에 포함 된 GFP 또는 암피실린 내성 마커 mKate2 식 9과 성장을 감소 셀룰러 리소스를 위해 경쟁 할 수있다. 마지막으로, 스르나 카세트 자체가 세계적으로 Hfq 단백질을 적정에 의해 유전자 발현 프로파일을 변경, 또는 오프 대상 mRNA의 입을 통해 할 수있다. 오프 대상 효과는 생체 RNAi의 21 ~ 23을 대상으로 일반적인, 그러나 그들은 체계적으로이 시스템에 대한 조사가 아직.
이 방법의 한 가지 제한은 감염 effi입니다ciency 일부 비 감염된 박테리아 집단에서 유지 할 수 있도록 100 % 미만이다. 이 작품 이전 작업 (10)의 결과는 비감염 세포가 최종 인구 1-10 %를 차지 제안하고, 관찰 nonsilenced 표현형의 대부분에 대한 책임이 있습니다. M13 저항에 다양한 경로는 pilus 식 (24)의 가장 보편적 인 돌연변이 손실 알려져있다. 이러한 제한의 관점에서, 컨트롤은 높은 감염 속도와 최저 효율을 확인하기 위해 사용되어야한다.
일부 응용 프로그램에 대한 또 다른 잠재적 인 제한은 헬퍼 파지를 오염 가끔 전송합니다. M13K07가 돌연변이 된 패키징 신호를 포함하지만,이 파지 생산 및 초기 감염 이벤트 (25)를 넘어 파지의 지속적인 보급 용 적격 세포 결과 저주파수 파지 캡시드로 패키징 감염된 인구에 전송 될 수있다. 헬퍼 파지에 대한 수정 효과 입증감소 된 파지 생산 (26)의 비용으로 비록 때때로, 비특이적 포장을 줄이는.
엔지니어링 박테리오파지는 E.위한 필수적인 도구가되었습니다 인구 증가에 새로운 유전자의 빠른 전송을 허용하는 대장균 합성 생물학. 최근의 연구는 세포 간 통신 회로 (11)를 생산 또는 항생제 내성을 억제하는 전사 인자를 표현 (27) 진학했다. 여기에 제시된 프로토콜은 프로그램 RNA를 통해 세균의 생리를 제어 할 수있는 도구의 성장 컬렉션에 추가합니다. 클레아 제 활성을 제거하기 위해 변이 할 때 CRISPR-카스의 뉴 클레아는, RNA 유도 유전자 목표 17,28에서 전사를 억제하는 것으로 나타났다. 반면, 스르나의 침묵은 번역 수준에서 작동 및 외래 단백질의 발현을 필요로하지 않습니다. 차세대 생명 공학 복잡한 pheno을 프로그램 파지 매개 배달 전사 및 번역 제어를 결합 할 수 있습니다실시간 유형.
The authors have nothing to disclose.
이 작품에 대한 자금은 파리 Bettencourt iGEM 팀의 지원에 파운데이션 부문 Bettencourt SCHUELLER에 의해 제공되었다. 우리는 기술 지원과 조언을 INSERM의 U1001 연구 장치와 샹탈 Lotton 감사합니다. 파지 미드 Litmus28i_J23115-B0032-GFP는 모니카 오티즈와 스탠포드의 드류 앤디에 의해 제공되었다.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |