We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
caídas de ARN mediada se utilizan ampliamente para controlar la expresión génica. Esta familia versátil de técnicas hace uso de RNA corto (sRNA) que se puede sintetizar con cualquier secuencia y diseñado para complementar cualquier gen diana para silenciamiento. Debido sRNA construcciones pueden introducirse a muchos tipos de células directamente o utilizando una variedad de vectores, la expresión del gen puede ser reprimida en las células vivas sin modificación genética laborioso. tecnología desmontables El ARN más común, RNA de interferencia (RNAi), hace uso de la secuencia de reconocimiento de ARN inducida por silenciar complejo (RISC) para mediar endógeno y la escisión del ARNm diana. Las aplicaciones de esta técnica son, por tanto, limitadas a los organismos RISC que expresan, principalmente eucariotas. Recientemente, una nueva generación de los biotecnólogos de ARN han desarrollado mecanismos alternativos para controlar la expresión génica a través de RNA, y así hecho posibles caídas de genes de ARN mediada en bacterias. Aquí se describe un método para silenciar genes expressión en E. coli que funcionalmente se asemeja a RNAi. En este sistema un fagémido sintético está diseñado para expresar sRNA, que puede diseñado para dirigirse a cualquier secuencia. La construcción de expresión se suministra a una población de E. células de E. coli con el fago no lítico M13, después de lo cual es capaz de replicarse de forma estable como un plásmido. Reconocimiento antisentido y el silenciamiento de ARNm diana está mediada por la proteína Hfq, endógena a E. coli. Este protocolo incluye métodos para el diseño de la sRNA antisentido, construir el vector fagémido, el envasado del fagémido en bacteriófago M13, la preparación de una población de células vivas para la infección, y la realización de la propia infección. La proteína fluorescente mKate2 y el cloranfenicol acetiltransferasa de genes de resistencia a antibióticos (CAT) se orientan a generar datos representativos y cuantificar la eficacia desmontables.
caídas de genes de ARN mediada por proceder en dos etapas. En primer lugar, una molécula de ARN se introduce en una línea de célula u organismo de estudio. En segundo lugar, las proteínas de unión a ARN endógenos facilitar el reconocimiento de ARN diana y producen el efecto silenciador. Todas las tecnologías de ARN desmontables se benefician de la naturaleza adaptable de sRNAs sintéticos, que puede ser producido fácilmente para que coincida con un objetivo específico de interés. Sin embargo, los detalles moleculares de la absorción de ARN y silenciamiento varían ampliamente a través de sistema de modelo, lo que limita dónde y cómo caídas de ARN se pueden aplicar.
En los nematodos, el ARN de doble cadena (dsRNA) moléculas se puede introducir directamente en los medios o mediante la alimentación de los gusanos con una población de dsRNA-expresión de E. células de E. coli de 1,2. En Drosophila, el ARNi se puede lograr mediante la microinyección de embriones con dsRNA 3, o implementadas en líneas celulares por simple adición de dsRNA al medio de cultivo 4. En líneas celulares de mamíferos,ARN de interferencia pequeños sintéticos (siRNAs) se pueden suministrar a las células vivas mediante electroporación 1,2,5, empaquetado en liposomas 3,6, o expresarse a partir de vectores de plásmidos de ADN de 4,7. Una vez que las especies de ARN alcanza el citosol, la vía de RNAi se basa en el complejo RISC para procesar dsRNA, facilitar el reconocimiento antisentido de la diana, y catalizar la represión de traducción, la degradación de mRNA, o la formación de heterocromatina, dependiendo del huésped.
Debido a estos requisitos, clásica ARNi puede ser realizado solamente en los organismos que ocupan ARN exógeno de manera eficiente y expresan RISC o una actividad similar a RISC. En particular, esto excluye el modelo bacteria E. coli, que carece de la vía de RNAi. Sin embargo, los recientes avances en la biología sintética proporcionan las herramientas para resolver tanto el problema de la entrega y el problema silenciamiento.
En este protocolo, las construcciones de sRNA se expresan en E. coli a partir de un vector de ADN entregado a living células utilizando el sistema de fagémido / M13 ayudante. Un fagémido es cualquier plásmido con un origen f1 de fago derivados de la replicación. Un plásmido auxiliar, en este caso M13KO, lleva toda la maquinaria necesaria para producir partículas virales, pero no es en sí competente para la replicación y el empaquetamiento. Cuando se co-transformaron un fagémido y el plásmido auxiliar, el fagémido solo se replica en el origen f1, envasa y se secreta. El fagémido vectorizado entonces será competente para infectar E. vivo coli mediante el pilus F.
En este sistema, el efecto de silenciamiento es producido por cassettes sRNA cliente combinando una secuencia andamio con una secuencia de unión a la diana. La secuencia de unión a diana es de 24 pares de bases antisentido a un ARNm diana, típicamente en el sitio de unión de ribosomas (RBS). La secuencia andamio, desarrollado por Na y colegas 8, contiene un motivo de unión Hfq extraída del MICC, un pequeño ARN regulador endógeno de E. coli. La proteína Hfq estimula RNA-RNA binding y la degradación del ARNm, que sirve una función en este sistema similar al RISC en RNAi. La Figura 1 muestra un esquema completo para caídas sRNA de fagos mediada, incluyendo la estructura sRNA casete, vectorización fagémido, y el mecanismo de silenciamiento.
Como un método para modular la expresión génica en E. coli, sRNA silenciamiento es simple, rápido y versátil. El E. dirigida coli no está cargado más allá de la propagación de la fagémido y expresando la sRNA. Esto puede ser relevante en el contexto de la biología sintética o de investigación básica, donde la expresión de las construcciones más grandes heterólogos puede tensar los recursos celulares 9. Los fagémidos con nuevos objetivos se pueden producir con una sola PCR y se recogieron un día después de la transformación de fagémido. Por último, casi cualquier ARNm puede ser objetivo. El casete de regulación sRNA (en un plásmido estándar) se ha demostrado que trabajar en una variedad de objetivos en el metabolismo con los niveles típicos de represión> 90% 8.
<p class = "jove_content"> Este protocolo se reproduce y se expande en un trabajo anterior usando-fagémido nacido sRNA cassettes 10. En primer lugar, un fagémido empaquetado se introduce en un cultivo discontinuo de E. células de E. coli y se utiliza para silenciar la expresión de la proteína fluorescente mKate2. cambios de fluorescencia posteriores se controlan en tiempo real. En segundo lugar, derribando el gen CAT se muestra para reducir la resistencia fenotípica al cloranfenicol en placas de agar. En ambos casos, el fagémido en sí lleva un marcador GFP, permitiendo que la tasa de infección a medirse independientemente de la eficiencia de caída.El presente procedimiento logra la reducción de 80% en los niveles de fluorescencia mKate comparación con los controles no orientados. Esto está en línea con otros métodos desmontables ARN, donde no se observa silenciamiento completo y la eficiencia del 50-90% es típico 16,17. A nivel fenotípico, caídas CAT orientados fueron capaces de atenuar de manera significativa la resistencia al cloranfenicol, y eliminarlo bajo algunas condiciones.
El desmontables fenotipo detectable a nivel de la población después de sólo unas pocas horas después de la infección (Figura 3B). Esto ilustra una característica importante de suministro basado en el fago: a alta frecuencia desmontables se puede obtener directamente en cultivo discontinuo sin modificación genética previa. A diferencia de las modificaciones genéticas convencionales utilizando la transformación plásmido o integración genómica, la infección por fagos no requiere que una población se re-cultiva a partir de una sola colonia aislada. Esto permite que los efectos de la infección del fago para ser explored en poblaciones con dinámicas espaciales complejas 11, con estructuras espaciales pre-existentes, como biopelículas 18, o en las poblaciones naturales mezclados genéticamente 19.
Un paso crítico en este método es la producción de fagémido empaquetados en alto título. La carga metabólica asociada con la producción de partículas de fago puede dar lugar a altas tasas de mutación o pérdida del plásmido en la cepa de producción fagémido. Se recomienda que la cepa de producción de fagémido se cultivó directamente de una sola colonia cotransformed y no refrigerado, congelado o sub-cultivadas antes de la cosecha del fago. A baja eficiencia de co-transformación también se puede observar cuando se introduce el fagémido y ayudante plásmido de E. coli simultáneamente. En este caso, las eficiencias más altas se pueden obtener mediante la transformación del plásmido auxiliar primero, a continuación, la preparación de células competentes que llevan el plásmido auxiliar para la transformación posterior con el fagémido.
phagemid infección o expresión sRNA también impone una carga metabólica detectable en las células diana, y pueden dar lugar a alguna perturbación fenotípica. Por ejemplo, se observó una reducción en la fluorescencia mKate2 incluso cuando las células se infectaron con un fagémido orientación CAT (Figura 3). La infección con M13 no se cree que desencadenan respuestas de estrés sistémicos en E. coli 20, pero puede alterar patrones de transcripción indirectamente. Alternativamente, los marcadores GFP o resistencia a la ampicilina incluidos en el fagémido pueden competir por los recursos celulares, la reducción de la expresión y el crecimiento 9 mKate2. Por último, el propio casete sRNA puede alterar globalmente perfiles de expresión génica mediante titulación de la proteína Hfq, o a través de fuera del objetivo silenciamiento de ARNm. Efectos de destino situados son comunes en la orientación in vivo ARNi 21-23, pero que aún no se han investigado sistemáticamente para este sistema.
Una limitación de este método es que la infección efieficiencia es menor que 100%, lo que permite algunas bacterias no infectadas a persisten en la población. Los resultados de este trabajo y el trabajo anterior 10 sugieren que las células no infectadas representan 1-10% de la población final, y son responsables de la mayor parte de los fenotipos observados nonsilenced. Se conoce una variedad de rutas a M13-resistencia, con el ser la pérdida de mutaciones más común de la expresión de pilus 24. A la luz de estas limitaciones, los controles deben ser usados para confirmar altas tasas de infección y la eficiencia desmontables.
Otra limitación potencial para algunas aplicaciones es la transferencia ocasional de contaminar el fago auxiliar. Aunque M13K07 contiene una señal de empaquetamiento mutada, puede ser empaquetado en la cápside del fago a baja frecuencia y se transfiere a las poblaciones infectadas, lo que resulta en células competentes para la producción de fago y la propagación continua de fago más allá del evento infección inicial 25. Modificaciones al fago auxiliar han demostrado ser eficacesen la reducción de los envases no específica, aunque a veces a costa de la reducción de la producción de fagos 26.
Bacteriófago ingeniería se han convertido en una herramienta indispensable para E. la biología sintética coli, lo que permite la entrega rápida de nuevos genes de una población en crecimiento. Trabajos recientes han producido circuitos de comunicación intercelular 11 o expresado factores de transcripción para suprimir la resistencia a los antibióticos vías 27. El protocolo que aquí se presenta se suma a una creciente colección de herramientas que permiten el control de la fisiología bacteriana a través de los ARN programados. Nucleasas CRISPR-cas, cuando mutado para eliminar la actividad nucleasa, se ha demostrado que reprimir la transcripción en objetivos de genes de ARN de guiado 17,28. Por el contrario, sRNA silenciamiento funciona a nivel de traducción y no requiere expresión de la proteína exógena. La próxima generación de biotecnologías pueden unir control de la transcripción y de la traducción con la entrega mediada por fagos para programar fenotipo complejotipos en tiempo real.
The authors have nothing to disclose.
La financiación de este trabajo fue proporcionado por la Fundación Bettencourt Schueller en apoyo del equipo de París Bettencourt iGEM. Agradecemos a la unidad de investigación INSERM U1001 y Chantal Lotton para la asistencia técnica y asesoramiento. Fagémido Litmus28i_J23115-B0032-GFP fue proporcionado por Mónica Ortiz y Drew Endy, de Stanford.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |