Wir beschreiben hier einen Test durch Kopplung DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifikation (DAMiD), um Hochdurchsatz-Sequenzierung (DAMiD-seq). Dieses verbesserte Verfahren bietet eine höhere Auflösung und einen größeren Dynamikbereich und erlaubt die Analyse DAMiD-seq Daten in Verbindung mit anderen Hochdurchsatz-Sequenzierung Daten wie ChIP-seq, RNA-seq usw.
The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.
DNA-Methyltransferase-Adenin-Identifikation (DAMiD) 1,2 ist eine Methode, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in vivo zu detektieren und ist ein alternativer Ansatz zur Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) 3. Es verwendet eine relativ geringe Menge an Zellen und keine chemische Vernetzung des Proteins mit der DNA oder einem hochspezifischen Antikörpers erforderlich. Letzteres ist insbesondere dann hilfreich, wenn das Zielprotein ist lose oder indirekt mit DNA verbunden. DAMiD wurde erfolgreich verwendet, um die Bindungsstellen aus einer Vielzahl von Proteinen, einschließlich Kernhüllenproteine 4-10, Chromatin-assoziierte Proteine 11-13, Chromatin modifizierender Enzyme 14, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren und 15-18 RNAi Maschinen 19 abzubilden. Das Verfahren ist in mehreren Organismen, einschließlich S. erhoben cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 sowie Maus und humanen Zelllinien 6,8,10,23,24.
Die Entwicklung des DAMiD Assay wurde auf den spezifischen Nachweis von Adenin-methylierten DNA-Fragmente in eukaryontischen Zellen, die endogene Adenin-Methylierung 2 fehlt basiert. Ein exprimiertes Fusionsprotein, bestehend aus der DNA-bindenden Proteins von Interesse und E. coli DNA-Adenin-methyltransferase (Dam), können die Adeninbase in GATC-Sequenzen, die in räumlicher Nähe befinden (am deutlichsten in 1 kb und bis zu etwa 5 kb) an die Bindungsstellen des Proteins in das Genom 2 methylieren. Die modifizierten DNA-Fragmenten, spezifisch amplifiziert und hybridisiert werden, um Mikroarrays, um die genomische Bindungsstellen des Proteins von Interesse 1,25,26 zu erfassen. Diese ursprüngliche DAMiD Verfahren wurde durch die Verfügbarkeit von Mikroarrays und der Dichte des vorbestimmten Sonden beschränkt. Daher haben wir in integrierten Hochdurchsatz-Sequenzierungum DAMiD 10 und bezeichnet das Verfahren, wie DAMiD-seq. Die große Anzahl von kurzen liest aus DAMiD-seq generiert ermöglicht eine präzise Lokalisierung von Protein-DNA-Interaktionen Genom-weiten. Wir fanden, dass DAMiD-seq vorgesehen eine höhere Auflösung und einen breiteren Dynamikbereich als DAMiD von Mikroarray für die Untersuchung genom Kernlamina (NL) 10 Verbände. Dieses verbesserte Verfahren ermöglicht Sondieren NL Assoziationen innerhalb Genstrukturen 10 und erleichtert den Vergleich mit anderen Hochdurchsatz-Daten, wie Chip-seq und RNA-seq.
Die hier beschriebene DAMiD-seq-Protokoll wurde ursprünglich für Mapping-Genom-NL Verbände 10 entwickelt. Wir erzielten ein Fusionsprotein angebunden Maus oder Mensch Lamin B1 bis E. coli DNA-Adenin-Methyltransferase und getestet, das Protokoll in 3T3 embryonalen Maus-Fibroblasten, Myoblasten C2C12 Maus 10 und IMR90 menschlichen fötalen Lungenfibroblasten (Daten nicht veröffentlicht). In diesem Protokoll, beginnen wir mit constructing Vektoren und ausdrücken Dam-gebundenen Fusionsproteine durch lentivirale Infektion in Säugetierzellen 24. Als nächstes beschreiben wir die ausführliche Protokolle zum Verstärken Adenin-methylierten DNA-Fragmente und Sequenzierung vorbereitet Bibliotheken, die in anderen Organismen anwendbar sein sollte.
Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of …
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Bas van Steensel for providing the DamID mammalian expression vectors. We thank Yale Center for Genome Analysis and the Genomics Core in Yale Stem Cell Center for advice on preparing NGS libraries and implementing high throughput DNA sequencing. This work was supported by the startup funding from Yale School of Medicine, a Scientist Development Grant from American Heart Association (12SDG11630031) and a Seed Grant from Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
Tris | brand not critical | ||
EDTA | brand not critical | ||
200 Proof EtOH | brand not critical | ||
Isopropanol | brand not critical | ||
Sodium Acetate | brand not critical | ||
DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
Klenow Fragment (3’ -> 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 11.2; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5X KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10mM dNTP mix |
agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
Spectrophotometer | brand not critical | ||
0.45 um PVDF Filter | brand not critical | ||
25 ml Seringe | brand not critical | ||
10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
Vortex Mixer | brand not critical | ||
Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
Microcentrifuge | brand not critical | ||
Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
UV transilluminator | brand not critical | ||
E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |