التصوير Ratiometric الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الأغشية الحيوية الأسنان
Summary
ويستخدم صبغة ratiometric الحساسة درجة الحموضة في تركيبة مع متحد البؤر المجهر الليزر وتحليل الصور الرقمية لمراقبة درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية الأسنان في الوقت الحقيقي.
Abstract
درجة الحموضة في الأغشية الحيوية البكتيرية على الأسنان ذات أهمية مركزية لتسوس الأسنان، وأمراض التي يتفشى في جميع أنحاء العالم. لا يتم توزيع المواد الغذائية ونواتج الأيض بالتساوي في الأغشية الحيوية الأسنان. وتفاعل معقد بين الامتصاص لوتفاعله مع المواد العضوية في بيوفيلم يقلل من طرق انتشار المواد المذابة ويخلق تدرجات حادة من الجزيئات المتفاعلة، بما في ذلك الأحماض العضوية، عبر بيوفيلم. طرق المجهرية الفلورسنت الكمية، مثل التصوير في الوقت حياة مضان أو ratiometry درجة الحموضة، ويمكن استخدامها لتصور درجة الحموضة في microenvironments مختلفة من الأغشية الحيوية الأسنان. درجة الحموضة ratiometry يستغل تحول تعتمد على درجة الحموضة في انبعاث الفلورسنت الأصباغ الحساسة درجة الحموضة. حساب نسبة الانبعاثات في اثنين من أطوال موجية مختلفة يسمح بتحديد درجة الحموضة المحلية في الصور المجهرية، بغض النظر عن تركيز الصبغة. وخلافا للالميكروية تقنية تتيح رصد كل التدرجات درجة الحموضة الرأسي والأفقي في الوقت الحقيقي معإزعاج من ميكانيكيا بيوفيلم. ومع ذلك، يجب الحرص على التفريق بدقة بين المقصورات من خارج وداخل الخلايا من بيوفيلم. هنا، وصبغ ratiometric، seminaphthorhodafluor-4F 5- (و6) حمض الكربوكسيلية (C-SNARF-4) يعمل على رصد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الجسم الحي في الأغشية الحيوية الأسنان نمت من تكوين الأنواع غير معروف. عند التعرض إلى جلوكوز الصبغة متروك المركزة داخل كل الخلايا البكتيرية في الأغشية الحيوية. وبالتالي استخدامه على حد سواء باعتبارها وصمة عار البكتيرية العالمية وكعلامة من الرقم الهيدروجيني خارج الخلية. بعد متحد البؤر الحصول على الصور المجهرية، تتم إزالة الكتلة الحيوية البكتيرية من كل الصور باستخدام برمجيات تحليل الصور الرقمية، والذي يسمح لحساب حصرا الرقم الهيدروجيني خارج الخلية. درجة الحموضة ratiometry مع الصبغة ratiometric هي مناسبة تماما لدراسة درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية رقيقة تصل إلى 75 ميكرون سمك، ولكن يقتصر على مجموعة ودرجة الحموضة بين 4.5 و 7.0.
Introduction
الطريقة الموصوفة هنا يسمح برصد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الأغشية الحيوية الأسنان في نطاق بين 4.5 و 7، وذلك باستخدام الصبغة ratiometric seminaphthorhodafluor-4F 5- (و6) حمض الكربوكسيلية (C-SNARF-4) في تركيبة مع متحد البؤر المجهر الليزر و تحليل الصور الرقمية. صبغة الفلورسنت العاملين هو الرقم الهيدروجيني الحساسة ويعرض تحولا في الانبعاثات الفلورسنت اعتمادا على حالة بروتوناتيون. انبعاث الفلورسنت من قمم جزيء البروتونية في 580 نانومتر، وانبعاث جزيء deprotonated في 640 نانومتر 1. نسبة كثافة الانبعاثات الفلورسنت في إطارين الكشف تضم قمم الانبعاثات اثنين (576-608 نانومتر، و629-661 نانومتر) مما يعكس درجة الحموضة في الطور السائل، بغض النظر عن تركيز الصبغة. مع وPK من ~ 6.4 الصبغة هو مناسب لتصور درجة الحموضة في البيئات الحمضية باعتدال.
PH في الأغشية الحيوية البكتيرية له أهمية مركزية لجميع عمليات التمثيل الغذائي.في حالة الأغشية الحيوية الأسنان، ودرجة الحموضة في المصفوفة خارج الخلية هو عامل الفوعة رئيسيا لتطوير تسوس الأسنان. فترات طويلة مع انخفاض الرقم الهيدروجيني في واجهة الصدارة بيوفيلم الأسنان لإبطاء التنقية من المينا الأساسي 2. ويرجع ذلك إلى بنية ثلاثية الأبعاد معقدة من الأغشية الحيوية، الأيض، بما في ذلك الأحماض العضوية، ليست موزعة بشكل موحد في جميع أنحاء بيوفيلم. ويمكن الاطلاع على غاية وأقل microenvironments مولد الحموضة في القرب المكاني 3.
على مدى عقود، وسجلت التدرجات درجة الحموضة العمودية في الأغشية الحيوية بمساعدة الميكروية 4-6. في حين أنها توفر دقة مكانية جيدة نظرا لحجم رأس صغير، وأنها ليست مناسبة تماما لمراقبة التدرجات الأفقية. وعلاوة على ذلك، الإدراج من القطب يزعج بيوفيلم ميكانيكيا. الكمية التقنيات المجهرية الفلورسنت توفر ميزة تصور التغييرات درجة الحموضة في مناطق مختلفة من بيوفيلم دون الميكانيكية التدخلالامتحانات التنافسية الوطنية. الحقول المجهرية نظر مختلفة يمكن اختيار بحرية وتصوير مرارا وتكرارا على مدى فترات طويلة 1،7-9. ومع ذلك، عند تفسير الصور بيوفيلم المجهرية، فمن المهم أن نميز بين مضان المستمدة من الكتلة الحيوية الميكروبية ومضان المستمدة من الفضاء خارج الخلية. في الظروف الحمضية، ودرجة الحموضة داخل الخلايا البكتيرية مختلفة من درجة الحموضة في المصفوفة خارج الخلية، حيث أن البكتيريا نقل بنشاط البروتونات عبر غشاء الخلية على حساب من أدينوسين ثلاثي الفوسفات 10. في سياق تسوس الأسنان، وليس لديها درجة الحموضة البكتيرية بين الخلايا لها تأثير مباشر على المينا الكامنة في حين انخفاض الرقم الهيدروجيني خارج الخلية يؤدي إلى التنقيه. بلغ متوسط درجة الحموضة في الصور المجهرية التي تحتوي على كل مناطق خالية من البكتيريا والجراثيم يؤدي إلى نتائج خاطئة. استخدام بقع أخرى جنبا إلى جنب مع صبغة حساسة درجة الحموضة من أجل رؤية الكتلة الحيوية البكتيرية والتفريق بين المناطق الخارجة عن والخلايا يجلب أبمن خطر التلوث الفلورسنت من الفضاء خارج الخلية والقياسات الخاطئة 11.
لذا يصف المخطوطة الحالية على استخدام الصبغة ratiometric في وظيفة مزدوجة؛ على حد سواء باعتبارها علامة درجة الحموضة وباعتباره وصمة عار البكتيرية العالمية. كما أن الصبغة هي يصل تتركز في الخلايا البكتيرية، والجمع بين التصوير المجهري متحد البؤر وإجراء تحليل الصور الرقمية دقيق يسمح تحديد الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في نطاق بين 4.5 و 7.0 في الأغشية الحيوية الأسنان رقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مراقبة مجهرية من درجة الحموضة بيوفيلم يوفر العديد من المزايا، بالمقارنة مع القطب أو مسرى مكروي القياسات 4-6. تسمح التقنيات المجهرية لتحديد درجة الحموضة مع دقة مكانية عالية والسماح التقاط التدرجات درجة الحموضة أفقيا ورأسيا في الأغشية الحيوية من دون إزعاج بيوفي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر خافيير غارسيا هاء ولين جرونكيار لتقديم المساعدة التقنية وMerete ك Raarup لإجراء مناقشات مثمرة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة أبحاث جامعة آرهوس وسيمون جواسيس مؤسسة.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Hunter, R. C., Beveridge, T. J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS. One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, O. C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N. P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397, 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511 (1999).
- Bender, G. R., Sutton, S. V., Marquis, R. E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338 (1986).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904 (1984).
- Daims, H., Lucker, S., Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y. L., Nascimento, M., Burne, R. A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
