Ratiometrisch Imaging von extrazellulären pH in Dental Biofilme
Summary
Ein pH-sensitive ratiometrisch Farbstoff wird in Kombination mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und digitale Bildanalyse zur Überwachung der extrazellulären pH in der dentalen Biofilme in Echtzeit verwendet.
Abstract
Der pH-Wert in der bakteriellen Biofilmen auf den Zähnen ist von zentraler Bedeutung für die Zahnkaries, eine Krankheit mit einer hohen Prävalenz weltweit. Nährstoffe und Metaboliten sind nicht gleichmäßig in der dentalen Biofilm verteilt. Ein komplexes Zusammenspiel von Sorption und Reaktion mit organischen Stoffen im Biofilm reduziert die Diffusionswege von gelösten Stoffen und schafft Steigungen von reaktiven Molekülen, einschließlich organische Säuren, über den Biofilm. Quantitative Fluoreszenz mikroskopische Methoden, wie Fluoreszenzlebenszeit-Bildgebung oder pH ratiometrischen können pH in unterschiedlichen Mikroumgebungen von dentalen Biofilmen zu visualisieren eingesetzt werden. pH ratiometrischen nutzt eine pH-abhängige Verschiebung in der Fluoreszenzemission von pH-empfindlichen Farbstoffen. Berechnung des Emissionsverhältnis bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen erlaubt die Bestimmung lokaler pH in mikroskopischen Bildern, unabhängig von der Konzentration des Farbstoffes. Im Gegensatz zu der Technik Mikroelektroden erlaubt sowohl vertikale als auch horizontale pH-Gradienten in Echtzeit-Überwachung mitaus mechanisch stören den Biofilm. Allerdings muss darauf geachtet werden genau zwischen extra- und intrazellulären Kompartimenten des Biofilms zu unterscheiden genommen werden. Hier ist die ratiometrisches Farbstoff, seminaphthorhodafluor-4F 5- (und-6) Carbonsäure (C-SNARF-4) verwendet wird , extrazellulären pH – Wert in in vivo gewachsen dentaler Biofilme unbekannter Artenzusammensetzung zu überwachen. Bei der Belichtung des Farbstoffes auf Glucose ist up-konzentriert innerhalb aller Bakterienzellen in den Biofilmen; Es ist somit sowohl als universelle bakterielle Flecken und als Marker des extrazellulären pH verwendet wird. Nach konfokalen mikroskopischen Bildaufnahme wird der Bakterienbiomasse aus allen Bildern mittels digitaler Bildanalyse-Software, entfernt, die extrazelluläre pH ausschließlich berechnen es erlaubt. pH ratiometrischen mit dem ratiometrisch Farbstoff ist gut geeignet extrazellulären pH in dünnen Biofilms von bis zu 75 & mgr; m Dicke zu untersuchen, wird jedoch auf den pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,0 begrenzt.
Introduction
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht im Bereich zwischen 4,5 und 7, mit der ratiometrisches Farbstoff in Kombination seminaphthorhodafluor-4F 5- (und-6) Carbonsäure (C-SNARF-4) in der dentalen Biofilm extrazellulären pH-Überwachung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie und Digitalbildanalyse. Der verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist pH-empfindlich und zeigt eine Verschiebung in der Fluoreszenzemission über den Stand der Protonierung abhängig. Die Fluoreszenzemission der protonierten Molekül – Peaks bei 580 nm und die Emission des deprotonierten Moleküls bei 640 nm 1. Das Verhältnis der Fluoreszenzemissionsintensitäten in zwei Detektionsfenster aus den beiden Emissionsspitzen (576-608 nm und 629-661 nm) reflektiert somit pH in der flüssigen Phase, und zwar unabhängig von der Farbstoffkonzentration. Mit einem pK a von ~ 6,4 ist der Farbstoff geeignete pH in mäßig sauren Umgebungen zu visualisieren.
PH in bakterielle Biofilme ist von zentraler Bedeutung für alle Stoffwechselprozesse.Im Falle von Zahn Biofilmen, pH in der extrazellulären Matrix ist der Schlüssel Virulenzfaktor für die Entwicklung von Zahnkaries. Verlängerte mit niedrigem pH – Wert an der Biofilm-Zahn – Schnittstelle führen zu verlangsamen Entmineralisierung des zugrunde liegenden Schmelz 2. Aufgrund der komplexen dreidimensionalen Architektur von Biofilmen, Metaboliten, einschließlich organische Säuren, sind nicht gleichmäßig über den Biofilm verteilt. Hoch und weniger acidogene Mikroumgebungen kann 3 in enger räumlicher Nähe zu finden.
Seit Jahrzehnten vertikale pH – Gradienten in Biofilme wurden mit Hilfe von Mikroelektroden 4-6 aufgezeichnet. Während sie eine gute räumliche Auflösung aufgrund ihrer geringen Größe Spitze bieten, sind sie nicht gut geeignet horizontalen Gradienten zu überwachen. Außerdem Einführen der Elektrode stört die mechanisch Biofilm. Quantitative Fluoreszenz mikroskopischer Techniken bieten den Vorteil der pH-Änderungen in verschiedenen Bereichen eines Biofilms Visualisierung ohne mechanische interferierennce. Verschiedene mikroskopische Sichtfelder können frei gewählt werden und immer wieder über längere Zeiträume 1,7-9 abgebildet. Wenn jedoch mikroskopische Biofilm Bilder interpretieren, ist es wichtig, zwischen Fluoreszenz zu unterscheiden von der mikrobiellen Biomasse und Fluoreszenz aus dem extrazellulären Raum Ableitung abzuleiten. Unter sauren Bedingungen, pH innerhalb Bakterienzellen unterscheidet sich von pH in der extrazellulären Matrix, wie die Bakterien aktiv 10 Protonen über die Zellmembran auf Kosten von Adenosintriphosphat transportieren. Im Zusammenhang mit der Zahnkaries, intrazelluläre bakterielle pH-Wert hat keinen direkten Einfluss auf die zugrunde liegenden Schmelz während niedrige extrazellulären pH-Wert auf Entmineralisierung führt. Averaging pH-Wert in mikroskopischen Bildern, die sowohl bakterienfreie Zonen und Bakterien enthalten führt zu falschen Ergebnissen. Die Verwendung anderer Flecken zusammen mit dem pH-empfindlichen Farbstoff, um die bakterielle Biomasse und differenzieren zwischen extra- und intrazellulären Bereiche bringt ab zu visualisierenaus dem Risiko einer fluoreszierenden Kontamination des extrazellulären Raum und falsche Messungen 11.
Die vorliegende Manuskript beschreibt daher die Verwendung des ratiometrisches Farbstoff in einer Doppelfunktion; sowohl als pH-Marker und als universelle bakterielle Fleck. Da der Farbstoff up konzentrierter in Bakterienzellen ist, erlaubt die Kombination von konfokalen mikroskopischen Abbildungs und ein genaues digitales Bildanalyseverfahren die Bestimmung der extrazellulären pH-Wert im Bereich zwischen 4,5 und 7,0 in dünnen dental Biofilmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopischen Überwachung von Biofilm pH bietet mehrere Vorteile, wie 4-6 Elektrode oder Mikroelektroden – Messungen verglichen. Die mikroskopische Techniken erlauben pH-Wert mit einer hohen räumlichen Auflösung zu bestimmen und ermöglichen sowohl horizontale als auch vertikale pH-Gradienten in Biofilmen Erfassung ohne den Biofilm mechanisch zu stören. Frühere Versuche von mikroskopisch kleinen pH – Überwachung gelang es jedoch nicht , zwischen extra- und intrazellulären pH – Wert in den Biofilmen <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Javier E. Garcia und Lene Grønkjær für die technische Unterstützung und Merete K. Raarup für fruchtbare Diskussionen. Diese Arbeit wurde von Aarhus University Research Foundation finanziert und die Simon Spies-Stiftung.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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