चिकित्सकीय biofilms में कोशिकी पीएच की ratiometric इमेजिंग
Summary
एक पीएच के प्रति संवेदनशील ratiometric डाई वास्तविक समय में दंत biofilms में बाह्य पीएच की निगरानी के लिए confocal माइक्रोस्कोपी लेजर स्कैनिंग और डिजिटल छवि विश्लेषण के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है।
Abstract
दांतों पर बैक्टीरियल biofilms में पीएच दंत क्षय, एक उच्च दुनिया भर में प्रसार के साथ एक रोग के लिए केंद्रीय महत्व का है। पोषक तत्वों और चयापचयों दंत biofilms में समान रूप से वितरित नहीं कर रहे हैं। biofilm में कार्बनिक पदार्थ के साथ करने के लिए sorption और प्रतिक्रिया का एक जटिल परस्पर क्रिया विलेय के प्रसार रास्तों कम कर देता है और प्रतिक्रियाशील अणुओं की खड़ी ढ़ाल, कार्बनिक अम्ल सहित बनाता है, biofilm भर में। ऐसे प्रतिदीप्ति जीवन समय इमेजिंग या पीएच ratiometry के रूप में मात्रात्मक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म तरीकों, दंत biofilms के विभिन्न microenvironments में पीएच कल्पना करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। पीएच ratiometry पीएच के प्रति संवेदनशील रंगों का फ्लोरोसेंट उत्सर्जन में एक पीएच निर्भर पारी का लाभ उठाते। दो अलग अलग तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन अनुपात की गणना सूक्ष्म छवियों में स्थानीय पीएच का निर्धारण करने की अनुमति देता है, डाई की एकाग्रता की परवाह किए बगैर। तकनीक Microelectrodes करने के साथ वास्तविक समय में दोनों क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर पीएच ढ़ाल निगरानी की अनुमति देता विपरीतबाहर यंत्रवत् biofilm परेशान। हालाँकि, ध्यान biofilm के अतिरिक्त और intracellular डिब्बों के बीच अंतर करने के लिए सही ढंग से लिया जाना चाहिए। इधर, ratiometric डाई, seminaphthorhodafluor-4F 5 (और -6) कार्बोक्जिलिक एसिड (सी-Snarf-4) अज्ञात प्रजाति रचना के vivo उगाया दंत biofilms में बाह्य पीएच की निगरानी के लिए कार्यरत है। डाई ग्लूकोज के लिए जोखिम पर अप-केंद्रित biofilms में सभी बैक्टीरियल कोशिकाओं के अंदर है; इस प्रकार यह एक सार्वभौमिक बैक्टीरियल दाग के रूप में और बाह्य पीएच की एक मार्कर के रूप में दोनों का इस्तेमाल किया जाता है। confocal सूक्ष्म छवि अधिग्रहण के बाद, बैक्टीरियल बायोमास सभी डिजिटल छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर है, जो विशेष रूप से बाह्य पीएच की गणना करने के लिए परमिट का उपयोग कर चित्रों से निकाल दिया जाता है। ratiometric डाई के साथ पीएच ratiometry 75 माइक्रोन मोटाई की पतली biofilms में बाह्य पीएच अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, लेकिन 4.5 और 7.0 के बीच पीएच रेंज तक सीमित है।
Introduction
विधि यहाँ वर्णित 4.5 और 7 के बीच सीमा में दंत biofilms में बाह्य पीएच की निगरानी, ratiometric डाई seminaphthorhodafluor-4F 5 (और -6) कार्बोक्जिलिक एसिड (सी-Snarf -4) confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में उपयोग की अनुमति देता है और डिजिटल छवि विश्लेषण। नियोजित फ्लोरोसेंट रंजक पीएच के प्रति संवेदनशील है और protonation की स्थिति पर निर्भर करता है अपने फ्लोरोसेंट उत्सर्जन में बदलाव को दिखाता है। 580 एनएम पर protonated अणु चोटियों के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन, और 640 एनएम 1 पर deprotonated अणु का उत्सर्जन। दो खिड़कियां पता लगाने में फ्लोरोसेंट उत्सर्जन तीव्रता के अनुपात से दो उत्सर्जन चोटियों शामिल (576-608 एनएम और 629-661 एनएम) इस प्रकार तरल चरण में पीएच को दर्शाता है, डाई एकाग्रता की परवाह किए बगैर। ~ 6.4 की एक पी एक साथ डाई मामूली अम्लीय वातावरण में पीएच कल्पना करने के लिए उपयुक्त है।
बैक्टीरियल biofilms में पीएच सभी चयापचय प्रक्रियाओं के लिए केंद्रीय महत्व का है।दंत biofilms के मामले में, बाह्य मैट्रिक्स में पीएच दंत क्षय के विकास के लिए महत्वपूर्ण विषैलापन कारक है। Biofilm से दांत इंटरफेस नेतृत्व में कम पीएच के साथ विस्तारित अवधि के अंतर्निहित तामचीनी 2 की विखनिजीकरण धीमा करने के लिए। biofilms, चयापचयों, कार्बनिक अम्ल के जटिल सहित तीन आयामी वास्तुकला के कारण, समान रूप से biofilm भर में वितरित नहीं कर रहे हैं। उच्च और कम अम्लजन microenvironments करीब स्थानिक निकटता 3 में पाया जा सकता है।
दशकों के लिए, biofilms में खड़ी पीएच ढ़ाल microelectrodes 4-6 की मदद से दर्ज किए गए। जबकि वे अपने छोटे टिप आकार की वजह से एक अच्छा स्थानिक संकल्प प्रस्तुत करते हैं, वे क्षैतिज ढ़ाल की निगरानी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड की प्रविष्टि यंत्रवत् biofilm आ रही है। मात्रात्मक फ्लोरोसेंट सूक्ष्म तकनीक के बिना यांत्रिक हस्तक्षेप एक biofilm के विभिन्न क्षेत्रों में पीएच परिवर्तन visualizing के लाभ की पेशकशnce। देखने के विभिन्न क्षेत्रों सूक्ष्म स्वतंत्र रूप से चयनित और लंबी अवधि के 1,7-9 बार बार imaged किया जा सकता है। हालांकि, जब सूक्ष्म biofilm छवियों की व्याख्या, यह महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति माइक्रोबियल बायोमास और प्रतिदीप्ति बाह्य अंतरिक्ष से पाने से पाने के बीच भेद करने के लिए है। अम्लीय परिस्थितियों में, बैक्टीरियल कोशिकाओं के अंदर पीएच के रूप में बैक्टीरिया सक्रिय रूप से adenosine triphosphate 10 की कीमत पर अपने कोशिका झिल्ली भर में प्रोटॉन परिवहन, बाह्य मैट्रिक्स में पीएच से अलग है। दंत क्षय के संदर्भ में, intracellular बैक्टीरियल पीएच अंतर्निहित तामचीनी पर सीधा प्रभाव पड़ता है, जबकि कम कोशिकी पीएच विखनिजीकरण की ओर जाता है नहीं है। सूक्ष्म छवियों है कि दोनों बैक्टीरिया से मुक्त क्षेत्रों और बैक्टीरिया होते में पीएच औसत गलत परिणाम होता है। आदेश बैक्टीरियल बायोमास कल्पना और अतिरिक्त और intracellular क्षेत्रों के बीच अंतर करने के लिए में पीएच के प्रति संवेदनशील डाई के साथ-साथ अन्य दाग का उपयोग एबी लाता हैझूठी माप 11 बाह्य अंतरिक्ष के फ्लोरोसेंट संदूषण का जोखिम और बाहर।
वर्तमान पांडुलिपि इसलिए एक डबल समारोह में ratiometric डाई के उपयोग का वर्णन; दोनों एक पीएच मार्कर के रूप में और एक सार्वभौमिक बैक्टीरियल दाग के रूप में। के रूप में डाई बैक्टीरियल कोशिकाओं में केंद्रित है, confocal सूक्ष्म इमेजिंग के संयोजन और एक सटीक डिजिटल छवि विश्लेषण प्रक्रिया पतली दंत biofilms में 4.5 और 7.0 के बीच सीमा में बाह्य पीएच का निर्धारण करने की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इलेक्ट्रोड या microelectrode माप 4-6 की तुलना में biofilm पीएच की सूक्ष्म निगरानी, कई लाभ प्रदान करता है। सूक्ष्म तकनीक एक उच्च स्थानिक संकल्प के साथ पीएच का निर्धारण और यंत्रवत् biofilm परेशान बिना biofilms में दोनों क्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए जेवियर ई गार्सिया और तकनीकी सहायता के लिए Lene ग्रोनजर और Merete लालकृष्ण Raarup को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम आरहूस विश्वविद्यालय रिसर्च फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया और साइमन जासूस फाउंडेशन।
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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