歯科バイオフィルムにおける細胞外のpHのレシオメトリックイメージング
Summary
pH感受性レシオメトリック色素は、リアルタイムでの歯科バイオフィルム中の細胞外のpHを監視するために、共焦点レーザー走査顕微鏡とデジタル画像解析と組み合わせて使用されます。
Abstract
歯に細菌のバイオフィルム中のpHは、虫歯のための中心的な重要性の高い世界的な罹患率と疾患です。栄養素および代謝物は、歯科用バイオフィルム中に均一に分散されていません。バイオフィルム中の有機物との吸着、反応の複雑な相互作用は、溶質の拡散経路が減少し、バイオフィルムを横切って、有機酸を含む反応性分子の急な勾配を、作成します。このような蛍光寿命イメージングまたはpH ratiometryとして定量的な蛍光顕微鏡法は、歯のバイオフィルムの異なる微小環境のpHを可視化するために使用することができます。 pH ratiometryは、pH感受性色素の蛍光発光におけるpH依存性のシフトを利用します。二つの異なる波長での発光比率の計算は関係なく、染料の濃度の、顕微鏡像で局所的なpHを決定することができます。技術の微小電極に反して、リアルタイムに垂直と水平の両方のpH勾配を監視することができうち機械的にバイオフィルムを乱します。しかし、ケアは、バイオフィルムの細胞外および細胞内区画の間を正確に区別するために注意しなければなりません。ここでは、レシオメトリック色素、seminaphthorhodafluor-4F 5-（および-6）カルボン酸（C-SNARF-4）は、未知の種組成の歯のバイオフィルム成長のin vivoでの細胞外のpHを監視するために使用されます。染料をグルコースに暴露されるまで濃縮したバイオフィルム内のすべての細菌細胞の内部にあります。したがって、ユニバーサル細菌染色ように外pHのマーカーとしても使用されます。共焦点顕微鏡画像を取得した後、細菌バイオマスは専ら外pHを計算することを可能にするデジタル画像解析ソフトウェアを使用して、すべての画像から除去されます。レシオメトリック色素とのpH ratiometryは、最大75ミクロンの厚さの薄いバイオフィルムで外pHを研究するためによく適しているが、4.5と7.0の間のpH範囲に限定されています。
Introduction
ここに記載された方法は、共焦点レーザー走査顕微鏡と組み合わせて、レシオメトリック色素seminaphthorhodafluor-4F 5-（および6）を使用して、4.5と7の間の範囲内の歯科バイオフィルム中のカルボン酸（C-SNARF-4）の細胞外のpHをモニターし、できデジタル画像解析。採用蛍光色素はpH感受性であり、プロトン化の状態に応じて、その蛍光発光の変化を表示します。 580 nmでのプロトン化分子のピークの蛍光発光、及び640nmの1での脱プロトン化分子の発光。 2つの発光ピークを含む二つの検出窓における蛍光発光強度の比は、（576 – 608 nmで629 – 661 nm）はこのようにかかわらず、染料濃度の、液相のpHを反映します。 〜6.4 のpKaを有する色素が適度に酸性の環境のpHを視覚化するのに適しています。
細菌バイオフィルム中のPHは、すべての代謝プロセスのための中心的な重要性です。歯のバイオフィルムの場合には、細胞外マトリックス中のpHは、虫歯の開発のための重要な病原性因子です。バイオフィルム歯インタフェースリードでの低pHの拡張期間が根底にあるエナメル質2の脱灰を遅らせることを意味します。有機酸を含むバイオフィルム、代謝産物の複雑な3次元構造に、均一にバイオフィルム全体に分散されていません。非常に少ない酸産生微小環境は、空間的に近接3に見出すことができます。
何十年もの間、バイオフィルムの縦pH勾配は、微小電極4-6の助けを借りて記録しました。彼らは、小さなチップサイズのための良好な空間分解能を提供していますが、彼らは水平勾配を監視する非常に適していません。また、電極の挿入は、機械的に、バイオフィルムを乱します。定量的蛍光顕微鏡技術は、機械的な干渉なしに、バイオフィルムの異なる領域におけるpH変化を可視化するという利点を提供しますNCE。ビューの異なる顕微鏡視野を自由に選択し、長期間1,7-9にわたって繰り返し撮像することができます。顕微鏡バイオフィルムの画像を解釈するときしかし、細胞外空間から派生微生物バイオマス及び蛍光に由来する蛍光を区別することが重要です。細菌が活発にアデノシン三リン酸10を犠牲にし、それらの細胞膜を横切ってプロトンを輸送するように酸性条件下では、細菌細胞内部のpHは、細胞外マトリックス中のpHと異なっています。低細胞外pHは脱灰につながる一方、虫歯の文脈において、細胞内細菌のpHが根底にあるエナメル質に直接影響を持っていません。細菌フリーエリアと細菌の両方を含む顕微鏡画像で平均化pHは、誤った結果につながります。細菌バイオマスを視覚化し、細胞外および細胞内領域を区別するために、pH感受性色素と一緒に他の汚れの使用は、ABをもたらします11外空間と偽の測定値の蛍光汚染のリスクアウト。
本原稿は、したがって、二重の機能でレシオメトリック色素の使用を記載します。 pHをマーカーとしておよびユニバーサル細菌染色の両方。染料は、細菌細胞中に濃縮ように、共焦点顕微鏡画像で正確なデジタル画像分析手順の組み合わせは4.5と細い歯科用バイオフィルムにおける7.0の範囲の外のpHを測定することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
バイオフィルムのpHの微小モニタリング電極又は微小電極の測定4-6と比較して、いくつかの利点を提供します。顕微鏡技術は、高い空間分解能でpHを決定し、機械的にバイオフィルムを乱すことなく、バイオフィルムの両方の水平および垂直のpH勾配を捕捉できるように許可します。微視的なpHモニタリングのこれまでの試みは、しかし、バイオフィルム1,7,9に外および細胞内pH…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、実りある議論のための技術支援とMerete K. Raarupためのハビエル・E.ガルシアとレネGrønkjærに感謝したいと思います。この作品は、オーフス大学研究財団によって資金を供給されたとサイモンは、財団をスパイ。
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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