Ex Vivo optogénétiques Dissection de circuits Peur en tranches cérébrales
Summary
approches optogénétiques sont largement utilisés pour manipuler l'activité neuronale et d'évaluer les conséquences pour le fonctionnement du cerveau. Ici, une technique est décrit que , lors de l' expression in vivo de l'activateur optique channelrhodopsin, permet une analyse ex vivo des propriétés synaptiques de longue portée spécifique et les connexions locales dans les circuits neuronaux liés à la peur.
Abstract
approches optogénétiques sont maintenant largement utilisées pour étudier la fonction des populations de neurones et les circuits en combinant l'expression ciblée des protéines activées par la lumière et la manipulation ultérieure de l'activité neuronale par la lumière. Channelrhodopsins (CHRS) sont de cations canaux de lumière-dépendants et quand fusionné à une protéine fluorescente permet leur expression pour la visualisation et l'activation simultanée de types cellulaires spécifiques et leurs projections axonales dans les zones définies du cerveau. Par injection stéréotaxique de vecteurs viraux, des protéines de fusion peuvent être constitutivement Chr ou sous certaines conditions exprimées dans des cellules spécifiques d'une région du cerveau définie, et leurs projections axonales peuvent ensuite être étudiées anatomiquement et fonctionnellement par l' intermédiaire de l' activation ex vivo optogenetic dans des tranches de cerveau. Ceci est d'une importance particulière lorsque l'on cherche à comprendre les propriétés synaptiques des connexions qui ne pouvaient pas être traitées avec des approches classiques de stimulation électrique, ou dans l'identification roman affele loyer et la connectivité efférente qui a déjà été mal comprise. Ici, quelques exemples illustrent comment cette technique peut être utilisée pour étudier ces questions à élucider les circuits liés à la peur dans l'amygdale. L'amygdale est une région clé pour l'acquisition et l'expression de la peur, et le stockage de la peur et de souvenirs émotionnels. De nombreuses preuves suggèrent que le cortex préfrontal médian (CPFm) participe à différents aspects de l'acquisition de la peur et de l'extinction, mais sa connectivité précise avec l'amygdale commence à peine à être compris. Tout d' abord, il est montré comment ex vivo activation optogenetic peut être utilisée pour étudier les aspects de la communication synaptique entre les afférences MPFC et les cellules cibles dans l'amygdale basolatérale (BLA). En outre, il est illustré comment cette approche ex vivo optogenetic peut être utilisé pour évaluer les nouveaux modèles de connectivité à l' aide d' un groupe de neurones GABAergiques dans l'amygdale, le pôle paracapsular intercalation de cellules (mpITC), à titre d'exemple.
Introduction
des outils précis pour la visualisation et l'activation simultanée de connexions spécifiques entre les zones du cerveau et des types spécifiques de neurones sont de plus en plus important dans la compréhension des fonctions cérébrales et des maladies connectivité fonctionnelle états sains sous-jacents. Idéalement, cela implique une enquête physiologique des propriétés synaptiques précises avec lesquelles identifiés neurones communiquent. Cela est particulièrement vrai pour les connexions entre les zones du cerveau qui ne peuvent être conservés dans une seule tranche de cerveau aiguë. Dans le passé, cela a été réalisé en grande partie dans des expériences séparées. D'une part, les traceurs neuronaux injectés in vivo ont été employés combinée à la lumière ultérieure ou de l' analyse au microscope électronique des partenaires pré- et post – synaptiques. D'autre part, lorsque des faisceaux de fibres à partir de la région d'origine sont conservées et accessibles dans la préparation de tranches, la stimulation électrique a été utilisé pour évaluer les mécanismes de communication synaptiques avec des cellules dans la région cible,.
Avec l'avènement de l' optogénétique, l'expression ciblée de cations-canaux de lumière-gated, comme Channelrhodopsins (CHRS) fusionnée à des protéines fluorescentes, permet désormais l' activation des neurones et de leurs trajectoires axonales tout en permettant leur visualisation et l' analyse post-hoc anatomique 1- 4. Parce que les axones ChR exprimant peuvent être stimulés même quand il est coupé du parent somata 5, il est possible dans le cerveau des tranches à: 1) évaluer les contributions des régions du cerveau qui ne sont pas accessibles avec une stimulation électrique classique parce que des faisceaux de fibres ne sont pas séparables ou la trajectoire spécifique On ne sait pas; 2) d'identifier sans équivoque la région d'origine pour les entrées spécifiques qui ont été postulées mais incomplètement comprises; et 3) étudier la connectivité fonctionnelle entre les types cellulaires définis, à la fois localement et dans les projections à long terme. En raison d'un certain nombre d'avantages, cette cartographie optogenetic de circuits dans des tranches de cerveau est devenu largely utilisé dans les dernières années, et une variété de vecteurs viraux pour l'expression de CHRS fluorescence marqués sont facilement disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Quelques avantages clés d'activation optogenetic sur la stimulation électrique conventionnelle ne sont pas des dommages aux tissus en raison de placement des électrodes de stimulation, la spécificité de la stimulation de la fibre parce que la stimulation électrique peut également recruter des fibres de passage ou d'autres cellules voisines, et une stimulation aussi rapide et temporellement précis. En outre, l' injection stéréotaxique de vecteurs viraux peut facilement être ciblée sur des zones spécifiques du cerveau 6 et une expression spécifique conditionnelle ou de type cellulaire peuvent être réalisés en utilisant l' expression Cre dépendant et / ou des promoteurs spécifiques 7. Ici, cette technique est appliquée pour la cartographie de longue portée et de circuits locaux dans le système de la peur.
L'amygdale est une région clé pour l' acquisition et l' expression de la peur, et le stockage de la peur et de souvenirs émotionnels 8,9. Outre from l'amygdale, le cortex médial préfrontal (CPFm) et de l' hippocampe (HC), des structures qui sont réciproquement connectés à l'amygdale, sont impliqués dans les aspects de l' acquisition, la consolidation et la récupération de la peur et d' extinction des souvenirs 10,11. L' activité dans les subdivisions de la CPFm semble jouer un double rôle dans le contrôle de la peur à la fois haute et basse déclare 12,13. Cela pourrait être en partie médiée par des liaisons directes de CPFm à l'amygdale qui permettrait de contrôler l'activité de l'amygdale et de sortie. Par conséquent, au cours des dernières années, plusieurs études ont commencé en ex vivo des expériences de tranche pour étudier les interactions synaptiques entre afférences MPFC et les cellules cibles spécifiques dans l'amygdale 14-17.
Au cours de l'apprentissage de la peur, l'information sensorielle au sujet conditionné et inconditionné stimuli atteint l'amygdale via des projections des régions thalamiques et corticales spécifiques. Plasticité de ces entrées pour les neurones dans la partie latérale (LA) du BASOLamygdale ateral (BLA) est un mécanisme important qui sous – tend la peur conditionné 9,18. Des preuves croissantes suggèrent que les processus de plastique parallèles dans l'amygdale impliquent des éléments inhibiteurs pour contrôler la peur mémoire 19. Un groupe de neurones inhibiteurs en cluster sont les GABAergiques paracapsular intercalés cellules médiales (de mpITCs), mais leur connectivité et la fonction précise est incomplètement compris 20-22. Ici, la cartographie du circuit optogenetic est utilisé pour évaluer afférentes et efférentes la connectivité de ces cellules et leur impact sur les neurones cibles dans l'amygdale, ce qui démontre que mpITCs reçoivent l' entrée sensorielle directe des stations de relais thalamiques et corticales 23. expression spécifique de ChR en mpITCs ou neurones BLA permet la cartographie des interactions locales, révélant que mpITCs inhibent, mais sont également mutuellement activé par, BLA principaux neurones, les plaçant dans des circuits inhibiteurs feed-forward et de rétroaction nouvelles qui contrôlent efficacement l'activité de BLA23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode ex vivo enquête optogenetic des circuits neuronaux et la connectivité locale qui peuvent être facilement mises en œuvre sur la plupart, sinon tous, debout tranche enregistrement patch-clamp configurations en les dotant d'une ~ 470 LED au port de lumière épifluorescence nm. Un avantage majeur de la stimulation optogenetic des projections axonales en tranches est qu'il permet l'activation et l'investigation des propriétés des connexions qui ne sont pas acc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
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