Hier wordt een protocol voorgelegd aan Kinesin-1 ladingen te identificeren. Een motorloze mutant van de kinesine-1 zware keten (KIF5B) aggregaten in het cytoplasma en induceert aggregatie van de ladingen. Beide aggregaten gedetecteerd onder fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om ladingen van andere auto eiwitten te identificeren.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesine-1 is een motor eiwit dat anterograde transport van de ladingen 1,2 medieert. Het is een heterotetrameer van de twee subeenheden van Kinesin lichte keten 1 (KLC1) en twee subeenheden van Kinesin zware ketens (KHCs). KIF5B 1, een KHC, bevat een motor domein aan het N-uiteinde, die ATP hydrolyseert en zet de chemische energie in mechanische energie voor beweging langs microtubules. De C-terminale regio bevat dimerisatie domein dat interageert met KLC1 die associeert met lading. Kinesine-1 transporteert ladingen zoals blaasjes, organellen en mRNA 3,4. Recentelijk KIF5B bleek de nucleaire transcriptiefactor c-MYC transporteren proteosomale voor afbraak in het cytoplasma 5. Drie methoden (chemische remmer, siRNA / shRNA en dominant negatieve mutant) gebruikt om kinesine-1 werking te remmen. Allen geïnduceerde aggregatie van c-MYC in het cytoplasma. De laatste methode, werd c-MYC alleen beïnvloed door de dominante negative mutant van KIF5B, maar niet door die van een andere verwante KIF5A motor eiwit, wat suggereert dat de mutant niet algemene effecten op de intracellulaire componenten (zoals microtubuli verstoren) of eiwitaggregatie uitoefent. De dominante negatieve mutant van KIF5B ook geen invloed op andere transcriptiefactor, wat suggereert dat zij algemene effecten op transcriptiefactoren uitoefent. In plaats daarvan suggereert dat de dominante negatieve mutant uitoefent specifieke effecten op de ladingen.
Het gebruik van dominant negatieve mutanten is gebruikelijk in het gebied van motorische eiwitten. Vergelijkbare motorloze mutanten van kinesins en myosins werden eerder gebruikte. Ze zijn vooral gebruikt om de effecten van de mutanten op het subcellulaire lokalisaties van hun lading of cellulaire functies 6-12 tonen. Minder nadruk werd gelegd op de ruimtelijke relatie tussen de mutanten en de getroffen door deze ladingen te zetten. In sommige incidenties werden de mutanten waargenomen co-lokaliseren met hun cargos 6,10.
De interactie tussen KIF5B en de bijbehorende eiwitten werd eerder bevestigd door de in vivo gist-twee-hybride-assay en biochemische pull-down assays zoals co-immunoprecipitatie en in vitro pull-down assays 13-16. In dit artikel wordt een extra visuele methode met behulp van fluorescentie microscopie beschreven KIF5B lading eiwitten te identificeren. De werkwijze gebruikt een motorless KIF5B mutant die fungeert als een dominant negatieve mutant. Deze aggregaten in het cytoplasma en aggregatie induceert van de ladingen.
De tagging van wild-type en motorloze KIF5B mutant met de fluorescerend eiwit tdTomato 17 in staat stelt hun visualisatie met behulp van fluorescentie microscopie. Het gemerkte KIF5B eiwitten samen worden weergegeven met een kandidaat eiwit gefuseerd met een ander fluorescerend eiwit met spectrale eigenschappen op geschikte wijze van het KIF5B tag. De gemerkte eiwitten worden direct waargenomen in levende cellenonder fluorescentiemicroscopie. Inductie van aggregatie van de kandidaat-eiwit door de motorloze KIF5B mutant zal bevestigen dat de kandidaat-eiwit is een in vivo lading KIF5B. Verder kan de tdTomato hebben KIF5B eiwit alleen tot expressie worden gebracht in de cellen om hun effecten te bestuderen op de lading endogene eiwitten. Later wordt immunofluorescentie microscopie uitgevoerd waarbij de getransfecteerde cellen gefixeerd en gekleurd met een antilichaam tegen het endogene kandidaat eiwit, gevolgd door een geschikt secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorescente kleurstof. In dit geval wordt de kandidaat endogene eiwit op het fysiologisch niveau bestudeerd. Vergelijkbare motorloze mutanten van andere motorische eiwitten kunnen worden bereid om hun lading te identificeren.
De beschreven werkwijze maakt gebruik van de eigenschappen van de motorloze KIF5B mutant die het vermogen om te bewegen langs de microtubules mist, maar het vermogen behoudt om dimeren met het wildtype KIF5B vormen en daardoor kan de tetramere eiwitten te interageren met dezelfde lading eiwitten als de wild-type KIF5B. Motorloze KIF5B daarom fungeert als een dominant negatieve mutant en formulieren mislocalized aggregaten met zijn lading. Deze methode is bewezen dat de kinesine-1 lading c-MYC identificeren (Figuur 1) 5. In dit artikel werd dezelfde motorloze KIF5B mutant gebruikt om p53 te identificeren als een potentiële lading van kinesine-1 (Figuur 2). Hieruit blijkt dat de methode haalbaar om andere ladingen identificeren van kinesine-1. Bovendien wordt de specificiteit van de mutant door het ontbreken van een effect van de mutant op de negatieve controle-eiwit c-Fos (figuur 3).
In dit protocol, de tdTomato-gelabeld wild-type of motorless KIF5B eiwit tezamen tot expressie gebracht met een ander fluorescent eiwit gelabeld kandidaat lading eiwit. In dit geval, levende cellen fluorescentie microscopie en imaging worden uitgevoerd. De vorming van de aggregaten kunnen worden opgespoord door time-lapse imaging. Als alternatief wordt het tdTomato-gelabeld eiwit alleen tot expressie gebracht en de kandidaat lading eiwit op de fysiologische niveaus wordt gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie microscopie met behulp van specifieke antilichamen. De fluorescerende eiwit tdTomato gekozen voor de helderheid en fotostabiliteit 17. Als de achtergrond is hoog als gevolg van auto-fluorescentie van de volledige DMEM medium, wordt medium zonder fenolrood gebruikt.
De motorloze KIF5B mutant vormt dimeren met het wild-type KIF5B stoichiometrisch. Daarom is het essentieel om voldoende motorless KIF5B mutant tot expressie dimeren met de wildtype tegenhanger vormen om de functie te remmen en aggregaten. Om dit probleem aan te pakken, optimalisatie van de exprsessieschijven van de motorloze mutant essentieel. Het wordt bereikt door een kleine motorless mutant die de dimerisatie domein. Bovendien, optimalisatie van de geschikte transfectiereagens en protocol is ook noodzakelijk. De duur van incubatie van HeLa cellen met het DNA / transfectiereagens werd geoptimaliseerd in HeLa cellen voor expressie van exogene eiwitten en cellevensvatbaarheid. De incubatieduur kan moeten worden geoptimaliseerd voor andere cellijnen.
Voor vergrotingen tussen 4X 40X, zijn geen dekking bril nodig. Cellen kunnen direct worden onderzocht in de putjes. Derhalve, in dit geval, het protocol is goedkoop en gemakkelijk. Voor vergrotingen boven 40X worden cellen gekweekt op dekglaasjes in de putten en na kleuring, worden op microscoop dia's voor onderzoek op grond van olie-immersie doelstellingen bevestigd.
Observatie van aggregaten van de motorloze KIF5B eiwit wordt beperkt door de grootte van het cytoplasma. Het is gemakkelijk om de sporenaggregaten in verschillende zoogdiercellen. Echter, is het relatief moeilijk om de aggregaten in neuronale cellen nemen wanneer het volume van het cytoplasma klein rond de kernen en in neurieten.
Het protocol wordt gebruikt om de associatie tussen KIF5B en ladingen naast de in vivo gist twee-hybride en biochemische pull-down assays 13-16 tonen. Al deze tests bepalen de vereniging onder verschillende fysieke omstandigheden en de resultaten daarvan kunnen elkaar aanvullen. Bovendien is het voordeel van deze fluorescentiebepaling boven andere assays is dat de regeling van subcellulaire lokalisatie van de ladingen door KIF5B aantonen (figuren 1 en 2).
Het protocol is niet beperkt tot KIF5B en kan worden gebruikt om ladingen van andere auto eiwitten, te identificeren zoals sommige andere kinesine motoren 3 en sommige van de myosine motoren 23,24 gebruikt bij intracellulair transport van ladingen 3. Deze motor-eiwitten bevatten ook motor domeinen voor beweging langs microtubuli voor kinesine motoren en microfilamenten voor myosine motoren, en opgerold-coil segmenten voor oligomerisatie. Meeste vormen homodimeren 3,23. Daarom kan een soortgelijke strategie te worden aangebracht door het creëren van hun motorless dominant negatieve mutanten hun ladingen identificeren.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |