Hier wird ein Protokoll vorgestellt Kinesin-1 Ladungen zu identifizieren. Ein motorlose Mutante des Kinesin-1 schweren Kette (KIF5B) Aggregate im Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Beide Aggregate werden unter Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Strategie Ladungen anderer Motor-Proteine zu identifizieren, eingesetzt werden.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesin-1 ist ein Protein, das Motor anterograden Transport von seiner Ladungen 1,2 vermittelt. Es ist ein Heterotetramer der beiden Untereinheiten von Kinesin Light Chain 1 (KLC1) und zwei Untereinheiten von Kinesin Schwere Ketten (KHCs). KIF5B 1, a KHC enthält einen Motor Domäne an ihrem N-Terminus, die hydrolysiert ATP und wandelt die chemische Energie in mechanische Energie zur Bewegung entlang Mikrotubuli. Seine C-terminale Region enthält die Dimerisierungsdomäne, die mit KLC1, die mit Ladungen assoziiert interagiert. Kinesin-1 transportiert Ladungen wie Vesikel, Organellen und mRNAs 3,4. Kürzlich wurde KIF5B die Kerntranskriptionsfaktor c-MYC für proteosomalen Abbau im Zytoplasma 5 zu transportieren gezeigt. Drei Methoden (chemischer Inhibitor, siRNA / shRNA und dominant negative Mutante) wurden verwendet, Kinesin-1-Funktion zu hemmen. Alle Aggregation von c-MYC in das Zytoplasma induziert. Für die letzte Methode, c-MYC wurde nur von der herrschenden negat betroffenive Mutante von KIF5B, aber nicht von der eines anderen verwandten KIF5A Motor Protein, was darauf hindeutet, dass die Mutante nicht allgemeine Wirkungen auf die intrazellulären Komponenten ausübt (wie Mikrotubuli Störung) oder Proteinaggregation. Die dominant negative Mutante von KIF5B wirkte sich auch keine andere Transkriptionsfaktor, was darauf hindeutet, dass es keine allgemeinen Auswirkungen auf die Transkriptionsfaktoren ausübt. Vielmehr schlägt er vor, dass die dominante negative Mutante spezifische Auswirkungen auf die Ladungen ausübt.
Die Verwendung von dominant negativen Mutanten ist auf dem Gebiet der Motorproteine gemeinsam. Ähnliche motorlosen Mutanten von kinesins und Myosine wurden bisher verwendeten. Sie wurden hauptsächlich verwendet, 6-12 die Wirkung der Mutanten auf die subzelluläre Lokalisation ihrer Ladungen oder auf zelluläre Funktionen zu demonstrieren. Weniger Wert wurde zwischen den Mutanten auf die räumliche Beziehung setzen und die von ihnen betroffen Ladungen. Jedoch in einigen Fälle wurden die Mutanten beobachtet zusammen lokalisieren mit ihren cargos 6,10.
Die Wechselwirkung zwischen KIF5B und die zugehörigen Proteine wurde zuvor von der in vivo Hefe-Zwei-Hybrid-Assay und biochemische Pull-down-Assays, wie Co-Immunpräzipitation und in vitro-Pulldown-Assays 13-16 bestätigt. In diesem Artikel wird eine zusätzliche visuelle Methode unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie beschrieben KIF5B Frachtproteine zu identifizieren. Das Verfahren verwendet eine motorlose KIF5B Mutante, die als dominant negative Mutante wirkt. Es vereinigt in das Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen.
Die Markierung von Wildtyp und motorlose KIF5B Mutante mit dem fluoreszierenden Protein tdTomato 17 ermöglicht, ihre Visualisierung von Fluoreszenzmikroskopie. Die markierten KIF5B Proteine können aus dem KIF5B Tag getrennt mit spektralen Eigenschaften in geeigneter Weise an einem anderen fluoreszierenden Protein fusioniert mit einem Kandidatenprotein coexprimiert werden. Die markierten Proteine werden direkt in lebenden Zellen beobachtetunter Fluoreszenzmikroskopie. Die Induktion der Aggregation des Kandidatenprotein durch die motorlose KIF5B Mutante wird bestätigen, dass die Kandidaten-Protein ist ein In-vivo-Ladung von KIF5B. Darüber hinaus können die tdTomato-markierten Proteine KIF5B allein in den Zellen exprimiert werden, um ihre Auswirkungen auf die endogene Ladung Proteine zu studieren. Später, Immunfluoreszenz-Mikroskopie durchgeführt wird, in dem die transfizierten Zellen fixiert und mit einem spezifischen Antikörper gegen den endogenen Kandidatenprotein, gefolgt von einem geeigneten sekundären Antikörper konjugiert ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt. In diesem Fall wird die endogene Kandidatenprotein an seinem physiologischen Ebene untersucht. Ähnliche motorlosen Mutanten von anderen Motorproteine hergestellt werden, ihre Ladungen zu identifizieren.
Das beschriebene Verfahren nutzt die Eigenschaften des motorlose KIF5B Mutante, die die Fähigkeit, entlang der Mikrotubuli zu bewegen fehlt, aber behält die Fähigkeit Dimere mit dem Wildtyp-KIF5B zu bilden und dadurch ermöglichen, die tetrameres Protein mit den gleichen Ladung Proteinen zu interagieren wie der Wildtyp-KIF5B. Freilaufendes KIF5B wirkt daher als dominant negative Mutante und Formen mislocalized mit ihren Ladungen zusammenfasst. Dieses Verfahren hat sich bewährt, die Kinesin-1 Fracht c-MYC (Abbildung 1) 5 zu identifizieren. In diesem Artikel wurde das gleiche motorlose KIF5B Mutante zu identifizieren p53 als eine weitere potentielle Ladung von Kinesin-1 (2) verwendet. Dies zeigt, dass die Methodik möglich ist, andere Ladungen von Kinesin-1 zu identifizieren. Darüber hinaus wird die Spezifität der Mutante durch das Fehlen der Wirkung der Mutante auf der negativen Kontrollprotein c-Fos (Figur 3) vorgesehen.
In diesem Protokoll, das tdTomato-markierten Wild tyPE oder motorlose KIF5B Protein wird mit einem anderen fluoreszierenden Protein-markierten Kandidaten Fracht Protein koexprimiert. In diesem Fall werden die lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie und bildgebende durchgeführt. Die Bildung der Aggregate durch Zeitraffer-Bildgebung verfolgt werden. Alternativ wird die tdTomato-markiertes Protein exprimiert allein und der Kandidat Ladung Protein an seine physiologischen Niveaus durch indirekten Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von spezifischen Antikörpern sichtbar gemacht. Das fluoreszierende Protein tdTomato 17 für die Helligkeit und Lichtstabilität gewählt. Wenn der Hintergrund durch Autofluoreszenz der kompletten DMEM-Medium hoch ist, Medium ohne Phenolrot verwendet wird.
Die motorlose KIF5B Mutante bildet Dimere mit dem Wildtyp-KIF5B stöchiometrisch. Daher ist es wichtig, eine ausreichende Menge an motorlose KIF5B Mutante auszudrücken Dimere mit dem Wildtyp-Gegenstück zu bilden, deren Funktion zu inhibieren und Aggregate zu bilden. Zur Bewältigung dieses Problems, die Optimierung der ausdrITZUNG des motorlosen Mutante ist von wesentlicher Bedeutung. Es wird unter Verwendung eines kleinen motorlose Mutante mit dem Dimerisierungsdomäne erreicht. Zusätzlich Optimierung des entsprechenden Transfektionsreagenz und Protokoll ist ebenfalls notwendig. Die Dauer der Inkubation von HeLa-Zellen mit dem DNA / Transfektionsreagenz wurde in HeLa-Zellen für die Expression von exogenen Proteinen und Zelllebensfähigkeit optimiert. Die Inkubationsdauer werden müssen für andere Zelllinien optimiert.
Für Vergrößerungen zwischen 4X bis 40X, werden keine Deckgläser erforderlich. Die Zellen können direkt in den Vertiefungen untersucht werden. Daher wird in diesem Fall ist das Protokoll, preiswert und einfach. Für Vergrößerungen über 40x, werden die Zellen auf Deckgläser in den Vertiefungen gewachsen und, nach dem Färben, montiert auf Objektträger zur Untersuchung unter Öl-Immersionsobjektive.
Beobachtung der Aggregate des motorlose KIF5B Protein wird durch die Größe des Zytoplasmas beschränkt. Es ist leicht, das zu erkennen,Aggregate in vielen Säugerzellen. Es ist jedoch relativ schwierig, die Aggregate in neuronalen Zellen zu beobachten, wenn das Volumen des Zytoplasma und um die Kerne in Neuriten klein ist.
Das Protokoll wird verwendet, um den Zusammenhang zwischen 13-16 KIF5B und ihre Ladungen zusätzlich zu der in vivo Hefe-Zwei-Hybrid und biochemische Pulldown-Assays zu zeigen. Alle diese Tests den Verein unter verschiedenen physikalischen Bedingungen bestimmen und ihre Ergebnisse gegenseitig ergänzen können. Darüber hinaus ist der Vorteil dieses Fluoreszenzassay im Vergleich zu anderen Assays, dass es die Regulierung der subzellulären Lokalisierung der Ladungen durch KIF5B zeigen können (1 und 2).
Das Protokoll ist nicht auf KIF5B beschränkt und kann verwendet werden Ladungen anderer Motor Proteine zu identifizieren, wie einige andere Kinesin Motoren 3 und einige der Myosin Motoren 23,24 in den intrazellulären Transport von Ladungen verwendet 3. Diese Motorproteine auch Motor-Domains für die Bewegung entlang von Mikrotubuli für Kinesin-Motoren und Mikrofilamenten für Myosinmotoren enthalten, und Coiled-Coil-Segmente für die Oligomerisierung. Die meisten von ihnen bilden Homodimere 3,23. Daher kann eine ähnliche Strategie zu ihnen angewendet werden durch ihre motorlose dominant negative Mutanten schaffen ihre Ladungen zu identifizieren.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |