ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
يوصف أسلوب ثقافة ثلاثي الأبعاد التي تزرع خلايا الورم الحميد في الغدة النخامية الأولية في حبات الجينات. الجينات هو بوليمر المستمدة من الطحالب البحرية البني. لفترة وجيزة، يتم قطع نسيج الورم إلى أجزاء صغيرة وتقديمها إلى الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز والتربسين. بعد ذلك، يتم الحصول على تعليق خلية. يتم خلط تعليق خلية الورم مع 1.2٪ الجينات الصوديوم وانخفض إلى 2 حل CaCl، وتبلور تعليق الجينات / الخلية على اتصال مع CaCl 2 لتشكيل حبات كروية. يتم تزويد الخلايا جزءا لا يتجزأ من الخرز الجينات مع المواد الغذائية التي تقدمها وسائل الإعلام الثقافة المخصب بنسبة 20٪ FBS. ثقافة ثلاثي الأبعاد في حبات الجينات يحافظ على سلامة خلايا الورم الحميد لفترات طويلة من الزمن، تصل إلى أربعة أشهر. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا يمكن أن تتحرر من الجينات عن طريق غسل الخرز مع سترات الصوديوم والمصنفة على coverslips الزجاج لإجراء المزيد من التحليلات immunocytochemical. استخدام سلنموذج الثقافة ل يسمح لتثبيت والتصور من الهيكل الخلوي الأكتين مع الحد الأدنى من الفوضى. وباختصار، توفر الخرز الجينات نظام الثقافة موثوق للحفاظ على خلايا ورم الغدة النخامية.
Introduction
وقد استخدمت السقالات ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع في زراعة الخلايا لأنها توفر الدعم الهيكلي ثلاثي الأبعاد للخلايا المستزرعة والحفاظ على خلية الى خلية الاتصال 1. وقد استخدمت مواد البوليمر المشتقة من الطبيعي أن يجعل السقالات ثلاثية الأبعاد بما في ذلك النوع الأول الكولاجين، الشيتوزان والجينات. الجينات هو بوليمر طبيعي مشتق من Macrocystispyrifera الطحالب البني البحر (عشب البحر). ويتكون هذا البوليمر وحدات متكررة من حمض β-D-mannuronic (M) وα-L-guluronic حمض (G) (2) وأشكال المواد الهلامية مستقرة في وجود بعض الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مثل الكالسيوم والباريوم. وتستخدم (CaCl 2) حلول كلوريد الكالسيوم عموما باسم كاشف يشابك لتشكيل الخرز الجينات. انخفضت حلول الجينات في CaCl 2 تشكيل الفور المواد الهلامية كروية ثلاثية الأبعاد. عندما يتم خلط حل الجينات مع الخلايا، يتم تغليف الخلايا في الجينات باي ايه دي اس 3.
لديها الجينات الخصائص التي مكنته من أن تستخدم مصفوفة لتغليف مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك غضروفية 4، myoblasts الهيكل العظمي 5 والخلايا الجذعية العصبية 6. ومن المواد الخاملة ويسمح للنشر المواد المغذية والأكسجين ومنتجات الأيض التي تحافظ على بقاء الخلية ووظيفتها. علاوة على ذلك، على عكس الأنظمة الأخرى التي تعتمد على ثقافة هلام، والخلايا مثقف داخل حبات الجينات يمكن أيضا أن تتحرر من السقالة باستخدام chelators الكالسيوم، مثل سترات الصوديوم، ويمكن بعد ذلك الخلايا أن تحصد لمزيد من التحقيقات 7.
أورام الغدة النخامية عادة أورام حميدة مع معدلات انتشار منخفضة. وكانت الفئران خطوط الخلايا ورم الغدة النخامية مثقف بنجاح في نظام ثنائي الأبعاد 8. ومع ذلك، هذه الثقافة من إفرازية أورام الخلايا النخامية الإنسان ليست تنمية كفاءة؛ فرقت الخلايا السرطانية في الغدة النخامية تنمو بشكل سيئفي الثقافة والخلايا يحمل المرفق محدود، ونشر، والخلايا عادة تشكل مجاميع العائمة في صحن الثقافة 9،10.
وقد بذلت عدة محاولات للحصول على تعليق ورم الخلايا النخامية، بما في ذلك النهج الأنزيمية وتشتت الميكانيكية 11، نهج تشتت الميكانيكية فقط 12 وزراعة من إإكسبلنتس ورم 10. مع هذه المناهج، والحصول على الكتاب مختلف الثقافات ملتصقة قابلة للحياة لفترات مختلفة من الزمن. قدرات الخلايا السرطانية إفرازية البقاء على قيد الحياة في هذه النظم ثنائية الأبعاد تعتمد على نوع الورم ومعدلات انتشارها 9. ومع ذلك، في الثقافات على المدى الطويل، والخلايا الليفية مع الظواهر تسود 11،13. وتصف هذه الورقة طريقة الحصول على ثقافة الأولية من خلايا الورم الحميد في الغدة النخامية مغلفة في حبات الجينات التي تحرر مزيد لهم من سقالة الجينات التي تمكن تحليلات مفصلة للجوانب بيولوجيا الخلية، وعلى سبيل المثال، ترتيباتها هيكل الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول لديه العديد من الخطوات الهامة. الأول هو حجم حبة التجانس، وهو مطلوب للحفاظ على نفس شروط نشر المواد المغذية والغازات في كل من زراعة الخلايا. في تجربتنا، واستخدام إبرة 21 G لجعل الخرز الجينات يسمح لاكتساب ثقافة كفاءة موحدة حجم حبة. العامل الثاني المهم هو ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
