Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Een driedimensionale kweekmethode beschreven waarbij primaire hypofyseadenoom cellen worden gekweekt in alginaatkorrels. Alginaat is een polymeer afgeleid uit bruine zeealgen. In het kort wordt het tumorweefsel in kleine stukjes gesneden en met collagenase en trypsine aan een enzymatische digestie ingediend. Vervolgens wordt een celsuspensie verkregen. De tumor celsuspensie wordt gemengd met 1,2% natriumalginaat en vallen in een CaCl2-oplossing, en de alginaat / cel suspensie wordt gegeleerd in contact met de CaCl 2 bolvormige korrels te vormen. De cellen ingebed in de alginaatkorrels voedingsstoffen aangeleverd door het kweekmedium aangevuld met 20% FBS. Driedimensionale kweek in alginaatkorrels de levensvatbaarheid van adenoom cellen voor langere tijd, tot vier maanden. Bovendien kunnen de cellen worden vrijgemaakt uit het alginaat door wassen van de bolletjes met natriumcitraat en gezaaid op glazen dekglaasjes voor verdere immunocytochemische analyse. Het gebruik van een cell cultuurmodel maakt de fixatie en visualisatie van het actine cytoskelet met minimale ontwrichting. Samengevat, alginaatkorrels een betrouwbare kweeksysteem voor het handhaven van hypofyseadenoom cellen.
Introduction
Driedimensionale steigers zijn uitgebreid gebruikt in celkweek omdat ze een driedimensionale structurele steun voor celcultuur en het onderhoud van cel-tot-cel communicatie 1. Natuurlijk verkregen polymere materialen zijn gebruikt om driedimensionale scaffolds inbegrip van type I collageen, chitosan en alginaat maken. Alginaat is een natuurlijk polymeer afkomstig van de bruine zeealgen Macrocystispyrifera (Kelp). Dit polymeer bestaat uit herhaalde eenheden van β-D-mannuronzuur (M) en α-L-guluronzuur (G) 2 en vormt stabiele gels in de aanwezigheid van bepaalde divalente kationen, zoals calcium en barium. Calciumchloride (CaCl2) oplossingen worden vaak gebruikt als de crosslinking reagens alginaatkorrels vormen. Alginaat oplossingen liet zich in CaCl2 onmiddellijk vormen driedimensionale bolvormige gels. Wanneer de alginaat oplossing gemengd met cellen, worden de cellen ingekapseld in de alginaat beads 3.
Alginaat eigenschappen die het had kunnen worden gebruikt als matrix voor het inkapselen van verschillende cellen, waaronder chondrocyten 4, skeletmyoblasten 5 en 6 neurale stamcellen. Het is een inert materiaal en maakt de diffusie van voedingsstoffen, zuurstof en stofwisselingsproducten die cel overleving en functie te behouden; Bovendien, in tegenstelling tot andere op gel gebaseerde kweeksystemen, cellen gekweekt in alginaat kralen kunnen ook worden vrijgemaakt uit het skelet via calciumvangers, zoals natriumcitraat, en de cellen kunnen vervolgens voor verder onderzoek 7 worden geoogst.
Hypofyseadenomen zijn meestal goedaardige tumoren met een lage proliferatie tarieven. Rat hypofyse adenoma cellijnen met succes gekweekt in een tweedimensionaal systeem 8 is. Echter, deze cultuur secretoire humane hypofyse celtumoren geen efficiënte ontwikkeling; verspreide tumor hypofyse cellen groeien slechtin kweek werden de cellen vertonen beperkte hechting en spreiding en de cellen vormen typisch drijven aggregaten in de kweekschaal 9,10.
Verschillende pogingen zijn gedaan om een tumor hypofyse celsuspensie te verkrijgen, zoals een enzymatische en mechanische dispersie benadering 11, een uitsluitend mechanische dispersie benadering 12 en het kweken van tumor explantaten 10. Met deze benaderingen hebben verschillende auteurs levensvatbare adherente kweken verkregen voor verschillende tijdsperioden. De capaciteit van de tumor secretoire cellen overleven in deze tweedimensionale systemen zijn afhankelijk van het tumortype en de proliferatiesnelheden 9. In langdurige kweken, cellen van fibroblast fenotypes overheersen 11,13. Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het verkrijgen van een primaire kweek van hypofyseadenoom cellen ingekapseld in alginaatkorrels dat ze verder vrijmaakt uit het alginaat scaffold uitvoerige analyses steltaspecten van de celbiologie, bijvoorbeeld hun cytoskelet regelingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol heeft een aantal kritische stappen. De eerste is korrelgrootte homogeniteit, die nodig is om dezelfde voorwaarden van diffusie van voedingsstoffen en gassen in alle van de celcultuur te behouden. In onze ervaring, het gebruik van een 21 G naald om de alginaatkorrels maken maakt het verkrijgen van een efficiënte kweek van uniforme grootte kraal. De tweede belangrijke factor is de afstand van de naald; deze afstand mag maximaal 5 cm van de calciumoplossing misvormde parels en dode cellen als gevolg van de bo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
