Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Un procédé de culture en trois dimensions est décrit dans lequel les cellules d'adénome hypophysaire primaire sont cultivées dans des billes d'alginate. L'alginate est un polymère dérivé d'algues brunes de la mer. En bref, le tissu tumoral est coupé en petits morceaux et soumis à une digestion enzymatique avec de la collagénase et de trypsine. Ensuite, une suspension cellulaire est obtenue. La suspension de cellules tumorales est mélangé avec de l'alginate de sodium à 1,2% et est tombé dans une solution de CaCl 2, et la suspension d'alginate / cellule est gélifiée au contact du CaCl 2 pour former des billes sphériques. Les cellules incluses dans les billes d'alginate sont alimentées en nutriments sont fournis par des milieux de culture enrichi avec 20% de FBS. culture tridimensionnelle dans des billes d'alginate maintient la viabilité des cellules d'adénome pendant de longues périodes de temps, jusqu'à quatre mois. En outre, les cellules peuvent être libérés de l'alginate par lavage des billes avec du citrate de sodium et ensemencées sur des lamelles en verre pour d'autres analyses immunocytochimiques. L'utilisation d'une cell modèle de culture permet la fixation et la visualisation du cytosquelette d'actine avec désorganisation minimal. En résumé, des billes d'alginate fournissent un système de culture fiable pour le maintien de cellules hypophysaires adénome.
Introduction
Échafaudages tridimensionnels ont été largement utilisés dans la culture de cellules, car ils fournissent un support structural tridimensionnel de cellules mises en culture et le maintien de la cellule à cellule communication 1. des matières polymères d'origine naturelle ont été utilisés pour fabriquer des échafaudages tridimensionnels dont collagène de type I, le chitosane et l'alginate. Alginate est un polymère naturel dérivé de l'algue Macrocystispyrifera de mer brune (varech). Ce polymère est composé d'unités répétées de β-D-mannuronique (M) et α-L-guluronique (G) 2 et forme des gels stables en présence de certains cations divalents tels que le calcium et le baryum. (CaCl 2) de solutions de chlorure de calcium sont couramment utilisés en tant que réactif de réticulation pour former des billes d'alginate. Des solutions d'alginate a chuté en CaCl2 former immédiatement gels sphériques tridimensionnels. Lorsque la solution d'alginate est mélangé avec des cellules, les cellules sont encapsulées dans l'alginate bEADS 3.
Alginate a des propriétés qui lui ont permis d'être utilisés comme matrice pour l'encapsulation d'une grande variété de cellules, y compris les chondrocytes 4, 5 myoblastes squelettiques et les cellules souches neurales 6. Il est un matériau inerte et permet la diffusion de nutriments, de l'oxygène et des produits métaboliques qui maintiennent la survie et la fonction des cellules; En outre, contrairement à d'autres systèmes de culture à base de gel, les cellules cultivées à l'intérieur des perles d'alginate peuvent également être libérés de l'échafaudage à l'aide des chélateurs de calcium, tels que le citrate de sodium, et les cellules peuvent ensuite être récoltées pour de plus amples investigations 7.
adénomes hypophysaires sont généralement des tumeurs bénignes avec des taux de prolifération faible. Rat lignes de cellules d'adénome hypophysaire ont été cultivées avec succès dans un système bidimensionnel 8. Cependant, cette culture de tumeurs sécrétoires de cellules de l'hypophyse humains ne sont pas un développement efficace; cellules pituitaires de tumeur dispersées poussent maldans la culture, les cellules présentent attachement limitée et la diffusion, et les cellules se forment généralement agrégats flottants dans la boîte de culture 9,10.
Plusieurs tentatives ont été faites pour obtenir une suspension de cellules de la tumeur pituitaire, y compris une approche enzymatique et la dispersion mécanique 11, une méthode de dispersion uniquement mécanique 12 et la mise en culture des explants tumoraux 10. Avec ces approches, différents auteurs ont obtenu des cultures adhérentes viables pour les différentes périodes de temps. Les capacités des cellules sécrétoires de la tumeur pour survivre dans ces systèmes à deux dimensions dépendent du type de tumeur et de leur taux de prolifération 9. Toutefois, dans des cultures à long terme, les cellules ayant des phénotypes de fibroblastes prédominent 11,13. Le présent document décrit un procédé d'obtention d'une culture primaire de cellules d'adénome hypophysaire encapsulés dans des billes d'alginate qui les libère en outre de l'échafaud d'alginate qui permet des analyses détaillées deaspects de leur biologie cellulaire, par exemple, leurs arrangements cytosquelette.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est la taille homogénéité bourrelet, qui est nécessaire pour maintenir les mêmes conditions de diffusion des nutriments et des gaz dans l'ensemble de la culture cellulaire. Dans notre expérience, l'utilisation d'une aiguille de 21 G pour rendre les perles d'alginate permet l'acquisition d'une culture efficace de taille uniforme de perles. Le deuxième facteur important est la distance entre l'aiguille; cette distance ne doit …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
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