Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Eine dreidimensionale Kulturverfahren ist in dem primären Hypophysenadenom Zellen sind in Alginatperlen gewachsen. Alginat ist ein Polymer aus Braun Meeresalgen abgeleitet. Kurz gesagt wird das Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und einer enzymatischen Verdauung mit Collagenase und Trypsin vorgelegt. Als nächstes wird eine Zellsuspension erhalten. Die Tumorzellsuspension wird mit 1,2% Natriumalginat gemischt und in eine CaCl 2 -Lösung und die Alginat / Zellsuspension wird bei Kontakt mit der CaCl 2 gelierten kugelförmigen Kügelchen zu bilden. Die Zellen in den Alginatkugeln eingebettet sind mit Nährstoffen durch die Kulturmedium, angereichert mit 20% FBS vorgesehen geliefert. Dreidimensionalen Kultur in Alginat-Perlen hält die Lebensfähigkeit der Zellen Adenom für längere Zeit, bis zu vier Monate. Darüber hinaus können die Zellen aus dem Alginat befreit werden, indem die Kügelchen mit Natriumcitrat gewaschen und für weitere immunzytochemischen Analysen auf Deckgläser ausgesät. Die Verwendung eines cell Kulturmodell ermöglicht die Fixierung und Visualisierung der Aktin-Zytoskelett mit minimalem Desorganisation. Zusammenfassend bieten Alginatkügelchen eine zuverlässige Kultursystem für die Wartung von Hypophysenadenom Zellen.
Introduction
Dreidimensionale Gerüste wurden in Zellkultur ausgiebig verwendet, weil sie eine dreidimensionale strukturelle Unterstützung für kultivierte Zellen und die Aufrechterhaltung der Zell-zu-Zell-Kommunikation 1 bereitzustellen. Natürlich abgeleitete Polymer-Materialien wurden zu machen dreidimensionalen Gerüsten einschließlich Typ I-Kollagen, Chitosan und Alginat. Alginat ist ein natürliches Polymer, abgeleitet von dem braunen Meeresalgen Macrocystispyrifera (Kelp). Dieses Polymer besteht aus wiederkehrenden Einheiten von β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) 2 und bildet stabile Gele in Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Kationen, wie Calcium und Barium. Calciumchlorid (CaCl 2) Lösungen werden als Vernetzungsreagens zu bilden Alginatkügelchen verwendet. Alginat-Lösungen fiel in CaCl2 sofort dreidimensionale kugelförmige Gele bilden. Wenn die Alginat-Lösung mit Zellen gemischt wird, werden die Zellen in das Alginat b eingekapseltEADS 3.
Alginat hat Eigenschaften, die es ermöglicht haben als Matrix für die Verkapselung von einer Vielzahl von Zellen verwendet werden, einschließlich Chondrozyten 4, Skelettmyoblasten 5 und 6 neuralen Stammzellen. Es ist ein inertes Material und ermöglicht die Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff und Stoffwechselprodukte, die das Überleben der Zelle und Funktion aufrechtzuerhalten; Darüber hinaus im Gegensatz zu anderen Gelbasis Kultursystemen, in Alginatperlen kultivierten Zellen können auch aus dem Gerüst unter Verwendung von Calciumchelatoren, wie Natriumcitrat, und die Zellen können dann für weitere Untersuchungen 7 geerntet werden freigesetzt werden.
Hypophysenadenomen sind in der Regel gutartige Tumoren mit niedrigem Proliferationsraten. Ratte Hypophysenadenom Zelllinien wurden in einem zweidimensionalen System 8 erfolgreich gezüchtet worden. Allerdings ist diese Kultur des sekretorischen menschlichen Hypophysen-Zelltumoren keine effiziente Entwicklung; schlecht dispergiert Tumor der Hypophyse Zellen wachsenin Kultur zeigen die Zellen begrenzte Anhaftung und Ausbreitung, und die Zellen bilden typischerweise Floating-Aggregate in der Kulturschale 9,10.
Mehrere Versuche wurden unternommen, einen Tumor hypophysären Zellsuspension, einschließlich einer enzymatischen und mechanischen Dispersion Ansatz 11 ist eine ausschließlich mechanische Dispersion Ansatz 12 und der Kultivierung von Tumor Explantate 10 zu erhalten, hergestellt. Mit diesen Ansätzen wurden verschiedene Autoren erhaltene lebensfähige anhaftende Kulturen für unterschiedliche Zeiträume. Die Kapazitäten der Tumor sekretorischen Zellen in diesen zweidimensionalen Systemen hängen von der Tumorart und ihre Proliferationsraten 9 zu überleben. Jedoch wird in Langzeitkulturen, Zellen mit Fibroblasten-Phänotypen wiegen 11,13. Dieser Beitrag beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Primärkultur von Hypophysenadenom Zellen in Alginatbeads eingekapselt zu erhalten, die weiter sie von der Alginat-Gerüst befreit, die detaillierte ermöglicht Analysen vonAspekte ihrer Zellbiologie, zB deren Zytoskelett-Arrangements.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Die erste ist Perlgröße Homogenität, die erforderlich ist, die gleichen Bedingungen der Diffusion der Nährstoffe und Gase in der gesamten Zellkultur aufrecht zu erhalten. Nach unserer Erfahrung ist die Verwendung einer 21 G Nadel der Alginatkügelchen ermöglicht die Übernahme eines effizienten Kultur einheitliche Perlengrße zu machen. Der zweite wichtige Faktor ist der Abstand von der Nadel; Dieser Abstand darf nicht mehr als 5 cm von der Calciumlösung verformt Per…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
