תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
שיטת תרבות תלת ממדים מתוארים שבו תאי אדנומה בבלוטת יותרת מוח העיקרי מגודלי חרוזי אלגינט. אלגינט הוא פולימר נגזר אצות ים חומות. בקצרה, רקמת הגידול נחתכה לחתיכות קטנות שהוגשה לבית עיכול אנזימטי עם collagenase טריפסין. לאחר מכן, השעית תא מתקבלת. השעית התאים הסרטנית היא מעורבב עם אלגינט נתרן 1.2% וצנחה פתרון 2 CaCl, ואת השעיית אלגינט / תא בג'ל על קשר עם CaCl 2 כדי ליצור חרוזים כדוריים. התאים מוטבעים החרוזים אלגינט מסופקים עם חומרים מזינים שמספקים התקשורת והתרבות הועשר 20% FBS. תלת ממד התרבות בחרוזי אלגינט שומרת על יכולת הקיום של תאי אדנומה לתקופות זמן ארוכים, עד ארבעה חודשים. יתר על כן, התאים יכולים להיות משוחררים מן אלגינט על ידי שטיפת החרוזים עם ציטראט נתרן זרעו על coverslips זכוכית עבור ניתוחי immunocytochemical נוספת. שימוש cell מודל התרבות מאפשר קיבוע וויזואליזציה של שלד התא אקטין עם חוסר ארגון מינימלי. לסיכום, חרוזי אלגינט לספק מערכת תרבות אמינה לשמירה על תאי אדנומה בבלוטת יותרת המוח.
Introduction
פיגומים תלת ממדי נעשה שימוש נרחב ב culturing תא כי הם מספקים תמיכה מבנית תלת ממדי עבור תאים בתרבית לבין שמירה על התא אל התא תקשורת 1. באופן טבעי חומרים פולימריים נגזר שימשו לעשות תלת מימדי פיגומים כולל סוג אני קולגן, chitosan ו אלגינט. אלגינט הוא פולימר טבעי נגזר Macrocystispyrifera אצות הים החום (קלפ). פולימר זה מורכב מיחידות חוזרות של חומצה β-D-mannuronic (M) ו α-L-guluronic חומצה (G) 2 וצורות ג'לים יציבים בנוכחות קטיונים divalent מסוימים, כגון סידן בריום. פתרונות סידן כלוריד (2 CaCl) משמשים גם מגיב crosslinking ליצירת חרוזי אלגינט. פתרונות אלגינט ירדו לתוך CaCl 2 להיוצר מייד ג'לים כדורי תלת ממדי. כאשר הפתרון אלגינט הוא מעורבב עם תאים, התאים במארז לתוך b אלגינטEADS 3.
יש אלגינט נכסים אשר אפשרו לו לשמש כמטריצה אנקפסולציה של מגוון תאים, כולל chondrocytes 4, myoblasts השלד 5 ותאי גזע עצביים 6. זהו חומר אינרטי ומתיר דיפוזיה של חומרים מזינים, חמצן ומוצרי מטבולית המקיימות תא הישרדות ותפקוד; יתר על כן, בניגוד למערכות תרבות אחר מבוסס ג'ל, תאים בתרבית בתוך חרוזי אלגינט יכול גם להיות משוחררת מן הפיגום באמצעות chelators סידן, כגון נתרן ציטרט, והתאים ניתן לקצור אז עבור חקירות נוספות 7.
אדנומות יותרת המוח הם בדרך כלל גידולים שפירים עם שיעורי התפשטות נמוך. שורות תאי יותרת המוח אדנומה עכברוש היו בתרבית בהצלחת מערכת דו-ממדית 8. עם זאת, התרבות זו של גידולי תא יותרת המוח אנושיים פרשה אינה פיתוח יעיל; תאי בלוטת יותרת המוח הגידול התפזרו לגדול גרועבתרבות, תאים להפגין מצורף מוגבלת והפצה, והתאים בדרך כלל בצורת אגרגטים צפה בצלחת התרבות 9,10.
מספר ניסיונות נעשו כדי לקבל השעיה תא יותרת המוח הגידול, כולל גישה האנזימטית פיזור מכני 11, גישה פיזור מכני אך ורק 12 ואת culturing של explants הגידול 10. עם גישות אלה, מחברים שונים שהשיגו תרבויות חסידות מעשיות עבור טווחים זמן שונים. הקיבולות של תאי פרשת גידול לשרוד במערכות דו ממדים אלה תלויים בסוג הגידול ושיעורי שגשוגם 9. עם זאת, בתרבויות לטווח ארוך, תאים עם פנוטיפים פיברובלסטים שולטים 11,13. המאמר זה מתאר שיטה לקבלת תרבות עיקרית מתא אדנומה בבלוטת יותרת המוח גלום חרוז אלגינט שמשחרר אותם עוד יותר מן הפיגום אלגינט המאפשר ניתוחים מפורטים שלהיבטים של הביולוגיה של התא שלהם, למשל, הסדרי cytoskeletal שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה יש כמה שלבים קריטיים. הראשונה היא ההומוגניות גודל חרוז, אשר נדרש כדי לשמור על אותם תנאים של דיפוזיה של חומרים מזינים וגזים בכל תרבית תאים. מניסיוננו, שימוש במחט G 21 לעשות את החרוזים אלגינט מאפשר לרכישת תרבות יעילה של גודל חרוז אחיד. הגורם החשוב השני הוא המר?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
