Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Un metodo di coltura tridimensionale è descritta in cui le cellule adenoma ipofisario primarie sono coltivate in perline alginato. Alginato è un polimero derivato da alghe brune mare. Brevemente, il tessuto tumorale è tagliato in piccoli pezzi e sottoposto ad una digestione enzimatica con collagenasi e tripsina. Successivamente, una sospensione cellulare viene ottenuta. La sospensione delle cellule tumorali viene miscelato con alginato di sodio 1,2% e rilasciato in una soluzione 2 CaCl, e la sospensione alginato / cellulare è gelificata a contatto con il CaCl 2 per formare perle sferiche. Le cellule incorporati nelle perle alginato sono forniti con nutrienti forniti dai terreni di coltura arricchito con 20% FBS. cultura tridimensionale in perline alginato mantiene la vitalità delle cellule adenoma per lunghi periodi di tempo, fino a quattro mesi. Inoltre, le cellule possono essere liberati dal alginato lavando le perline con citrato di sodio e seminate su vetrini per ulteriori analisi immunocitochimica. L'uso di un celModello L cultura consente il fissaggio e la visualizzazione del citoscheletro di actina con il minimo disorganizzazione. In sintesi, perline alginato forniscono un sistema di coltura affidabile per il mantenimento delle cellule adenoma pituitario.
Introduction
Scaffold tridimensionali sono stati ampiamente utilizzati in coltura cellulare perché forniscono un sostegno strutturale tridimensionale per colture cellulari e la manutenzione di comunicazione 1 cellula-cellula. materiali polimerici Naturalmente derivati sono stati utilizzati per fare impalcature tridimensionali contenenti collagene di tipo I, chitosano e alginato. Alginato è un polimero naturale derivato dalle alghe Macrocystispyrifera mare marrone (Kelp). Questo polimero è composto di unità ripetute di acido β-D-mannuronico (M) e α-L-guluronico acido (G) 2 e forma gel stabili in presenza di alcuni cationi bivalenti, come calcio e bario. (CaCl 2) soluzioni di cloruro di calcio vengono comunemente usati come reagente di reticolazione per formare perline alginato. Le soluzioni di alginato è sceso in CaCl 2 formare immediatamente gel sferici tridimensionali. Quando la soluzione di alginato viene miscelato con cellule, le cellule sono incapsulati in alginato bEADS 3.
Alginato ha proprietà che hanno permesso di essere utilizzato come matrice per l'incapsulamento di una varietà di cellule, comprese condrociti 4, mioblasti scheletrici 5 e cellule staminali neuronali 6. È un materiale inerte e permette la diffusione di nutrienti, ossigeno e prodotti metabolici che mantengono la sopravvivenza cellulare e la funzione; Inoltre, a differenza di altri sistemi di coltura a base di gel, cellule coltivate all'interno perline alginato possono essere liberati dal scaffold usando chelanti del calcio, come citrato di sodio, e le cellule possono essere raccolte per ulteriori accertamenti 7.
adenomi ipofisari sono in genere tumori benigni con tassi di proliferazione bassi. Linee cellulari adenoma pituitario di ratto sono state correttamente coltivate in un sistema a due dimensioni 8. Tuttavia, questa cultura di tumori a cellule dell'ipofisi umane secrezione non è uno sviluppo efficiente; Le cellule tumorali ipofisarie disperse crescono poconella cultura, le cellule mostrano attaccamento limitata e la diffusione, e le cellule tipicamente formano aggregati galleggianti nel piatto cultura 9,10.
Diversi tentativi sono stati fatti per ottenere una sospensione di cellule tumorali dell'ipofisi, compreso un approccio enzimatica e dispersione meccanica 11, un approccio dispersione esclusivamente meccanica 12 e la coltura di espianti tumorali 10. Con questi approcci, diversi autori hanno ottenuto culture aderenti vitali per diversi periodi di tempo. Le capacità delle cellule tumorali secretorie di sopravvivere in questi sistemi bidimensionali dipendono dal tipo di tumore e loro tassi di proliferazione 9. Tuttavia, nelle culture a lungo termine, le cellule con fenotipo di fibroblasti predominano 11,13. Questo documento descrive un metodo per ottenere una coltura primaria di cellule d'adenoma pituitario incapsulate in perline di alginato che li libera lontano dalla scaffold alginato che consente analisi dettagliateaspetti della loro biologia cellulare, ad esempio, le loro disposizioni del citoscheletro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo ha diversi passaggi critici. Il primo è l'omogeneità formato del branello, che è necessario per mantenere le stesse condizioni di diffusione dei nutrienti e gas in tutta la coltura cellulare. Nella nostra esperienza, l'uso di un ago 21 G per rendere le perline alginato consente l'acquisizione di una cultura efficace di formato del branello uniforme. Il secondo fattore importante è la distanza tra l'ago; questa distanza deve essere non più di 5 cm dalla soluzione di calcio per evita…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
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