인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
삼차원 배양 방법을 설명하는 기본 뇌하수체 샘종 세포 알긴산 비드에서 성장된다. 알긴산 갈색 해조류 유래의 중합체이다. 간략하게, 종양 조직은 작은 조각으로 절단하고 콜라겐와 트립신 효소 소화에 제출된다. 이어서, 세포 현탁액이 얻어진다. 종양 세포 현탁액을 1.2 %의 알긴산 나트륨과 혼합 CaCl2를 적하하고, 알긴산 / 세포 현탁액을 구형 비드를 형성하기 위해 염화칼슘 2 접촉 겔화된다. 알긴산 비드에 포함 된 세포를 20 % FBS가 풍부한 배지에서 제공 영양분 공급된다. 알긴산 비드의 삼차원 배양 4 개월까지 장시간 선종 세포의 생존력을 유지한다. 또한, 세포는 시트르산 나트륨과 함께 비드를 세척하여 알긴산으로부터 해방 또한 면역 세포 화학적 분석을위한 커버 글라스에 접종 할 수있다. CEL의 사용난 문화 모델은 최소한의 해체와 액틴 세포 골격의 고정 및 시각화 수 있습니다. 요약하면, 알긴산 비드 뇌하수체 샘종 세포의 유지를위한 안정적인 배양 시스템을 제공한다.
Introduction
들은 배양 된 세포에 대한 입체 구조적지지 및 세포 간 통신 (1)의 유지 보수를 제공하기 때문에 삼차원 지지체 광범위 세포 배양에 사용되어왔다. 천연 유래 고분자 물질은 I 형 콜라겐, 키토산, 알긴산 등 3 차원 지지체를 만들기 위해 사용되었다. 알긴산은 갈색 해조류의 Macrocystispyrifera (다시마)에서 파생 된 천연 중합체이다. 이러한 중합체는 β-D-만누 산 (M) 및 α-L-guluronic 산 (G), 예컨대 칼슘 및 바륨과 같은 특정 가의 양이온의 존재 하에서 2 형태 안정한 겔 반복 단위로 구성된다. 염화칼슘 (CaCl2를) 솔루션은 일반적 알긴산 비드를 형성하는 가교 결합 시약으로 사용된다. 알긴산 솔루션은 즉시 입체 구형 겔을 형성 염화칼슘 (2)로 떨어졌다. 알지네이트 용액을 세포와 혼합 될 때, 세포는 알긴 B로 캡슐화EADS 3.
알긴산은 그것을 활성화 특성 연골 4, 5 및 골격 근육 모세포 신경줄 기세포 6 포함한 세포의 다양한 밀봉 용 매트릭스로서 사용되어야한다. 불활성 물질이며, 영양분, 산소 및 세포의 생존과 기능을 유지 대사 산물의 확산을 허용한다; 또한, 다른 겔 기반 배양 시스템과 달리, 알긴산 비드 내 배양 세포는 소듐 시트 레이트, 칼슘 킬 레이터를 사용하여 지지체로부터 유리 될 수 있고, 세포를 추가로 조사 7 수확 할 수있다.
뇌하수체 선종은 일반적으로 낮은 확산 속도와 양성 종양이다. 쥐 뇌하수체 선종 세포주 이차원 시스템 (8)에서 성공적으로 배양되었다. 그러나, 인간의 뇌하수체 분비 세포 종양이 배양 효율적인 발전 아니다; 분산 뇌하수체 종양 세포 성장 저조한배양, 세포 부착 및 확산 제한을 나타내고, 상기 세포는 전형적으로 배양 접시 9,10 부동 응집체를 형성한다.
몇몇 시도가 효소 및 기계적 분산 방식 (11)만으로 기계식 분산 방식 (12) 및 암 (10)의 이식편 배양 포함한 뇌하수체 종양 세포 현탁액을 수득되었습니다. 이러한 방식으로, 다른 저자는 시간의 다른 기간 동안 가능한 자기편 문화를 얻었다. 종양 분비 세포의 용량은 종양 유형 및 확산 속도에 의존하는 이들 9 이차원 시스템에서 생존한다. 그러나, 장기간 배양 섬유 아세포 표현형을 가진 세포를 11,13은 우세. 이 논문은 상기의 상세한 분석이 가능 알긴산 지지체 그들을 해방 알긴산 비드 캡슐화 뇌하수체 선종 세포 초대 배양을 얻는 방법을 설명자신의 세포 생물학, 예를 들어, 자신의 세포 골격 준비의 측면.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 제는 세포 배양 물 모두에서 영양소와 가스 확산 동일한 조건을 유지하는 데 필요한 비드 크기의 균일 성이다. 우리의 경험에 의하면, 알긴산 비드를 만들기 위해 21 G 바늘의 사용은 균일 한 비드 크기의 효율적인 문화의 취득이 가능합니다. 두번째 중요한 요소는 바늘의 거리이고; 이 거리는 칼슘 용액을 5 센티미터 칼슘 용액의 표면에 알긴산 / 세…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
