Трехмерная альгинат-шарик культуре человеческих клеток аденомы гипофиза
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Способ трехмерного культивирования описан в котором аденома клетки первичной гипофиза выращивают в альгинатные гранулы. Альгинат является полимер, полученный из бурых морских водорослей. Вкратце, опухолевая ткань разрезают на мелкие кусочки и представлен на ферментативным расщеплением коллагеназой и трипсином. Далее, клетки суспензию. Суспензию опухолевых клеток смешивали с 1,2% альгината натрия и по каплям в 2 раствора CaCl, и альгинат / клеточную суспензию гелеобразное при контакте с CaCl 2 с образованием сферических шариков. Клетки, встроенные в альгинатные гранулы поставляются с питательными веществами, предоставляемых культуральных средах, обогащенных 20% FBS. Трехмерная культура в альгинатные гранулы сохраняет жизнеспособность клеток аденомы в течение длительных периодов времени, до четырех месяцев. Кроме того, эти клетки могут быть освобождены от альгината путем промывки бусины с цитрат натрия и высевали на покровные стекла для дальнейших анализов иммуноцитохимических. Использование челМодель L культура позволяет для фиксации и визуализации цитоскелета с минимальным дезорганизации. Таким образом, альгинатные гранулы обеспечивают надежную систему культуры для поддержания клеток аденомы гипофиза.
Introduction
Трехмерные каркасы были широко используется в культивирования клеток, поскольку они обеспечивают трехмерное структурную поддержку для культивируемых клеток и поддержание клетки к клетке связи 1. Естественно, полученные полимерные материалы были использованы, чтобы сделать трехмерные каркасы включая тип I коллаген, хитозан и альгинат. Альгинат является естественным полимером, полученным из водорослей Macrocystispyrifera коричневый моря (Kelp). Этот полимер состоит из повторяющихся звеньев β-D-маннуроновой кислоты (М) и & alpha; -L-гулуроновой кислоты (G) 2 и образует стабильные гели в присутствии определенных двухвалентных катионов, таких как кальций и барий. (CaCl 2) растворы хлорида кальция обычно используются в качестве реагента сшивающего чтобы сформировать альгинатные гранулы. Растворов альгинатов упал в CaCl 2 немедленно сформировать трехмерные сферические гели. Когда раствор альгината смешивают с клетками, клетки инкапсулированы в альгината бEADS 3.
Альгинат имеет свойства, которые дают ему возможность быть использованы в качестве матрицы для инкапсуляции различных клетках, в том числе хондроцитами 4, скелетных миобластов 5 и нервных стволовых клеток 6. Это инертный материал и допускает диффузию питательных веществ, кислорода и продуктов метаболизма, которые поддерживают выживание и функции клеток; кроме того, в отличие от других систем культивирования гелевых основе, клетки, культивируемые в течение альгинатные гранулы могут также быть освобождены от эшафота использованием энтеросорбенты кальция, такие как цитрат натрия, и клетки затем могут быть собраны для дальнейших исследований 7.
Аденомы гипофиза, как правило, доброкачественные опухоли с низким уровнем распространения. Крысы линии аденомы гипофиза клеточные были успешно культивируют в двумерной системе 8. Тем не менее, эта культура секреторных опухолей гипофиза клеток человека не является эффективным развитие; дисперсные опухоли гипофиза клетки растут слабов культуре, клетки обладают ограниченной прикрепление и распространение, и клетки обычно образуют плавающие агрегаты в культуральной чашке 9,10.
Несколько попыток было сделано, чтобы получить опухоль гипофиза клеточной суспензии, в том числе ферментативной и механической дисперсионного подхода 11, только с механической дисперсионного подхода 12 и культивирования опухолевых эксплантов 10. С помощью этих подходов, разные авторы получили жизнеспособные прилипшие культур в течение различных периодов времени. Мощности опухоли секреторных клеток выживать в этих двумерных систем зависит от типа опухоли и их скорости пролиферации 9. Тем не менее, в долгосрочной культур, клетки с фибробластов фенотипов преобладают 11,13. Этот документ описывает способ получения первичной культуры от аденомы гипофиза клеток, инкапсулированных в альгинатные гранулы, которые дополнительно высвобождает их из альгината помост, который позволяет подробный анализаспекты их клеточной биологии, например, их цитоскелета договоренностей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол имеет несколько важных шагов. Первый шарик размером однородности, который необходим для поддержания те же условия диффузии питательных веществ и газов в каждом из клеточной культуры. По нашему опыту, использование 21 G иглы, чтобы сделать альгинатные гранулы позволяет для…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
