Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Se describe un método de cultivo en tres dimensiones en el que las células de adenoma de la pituitaria primaria se cultivan en perlas de alginato. El alginato es un polímero derivado de algas pardas marinas. Brevemente, el tejido tumoral se corta en trozos pequeños y se sometió a una digestión enzimática con colagenasa y tripsina. A continuación, se obtiene una suspensión de células. La suspensión de células tumorales se mezcla con alginato de sodio 1,2% y se dejó caer en una solución de CaCl 2, y la suspensión de alginato / célula se gelifica al contacto con el CaCl 2 para formar perlas esféricas. Las células incrustadas en las perlas de alginato se suministran con nutrientes proporcionados por los medios de cultivo enriquecidos con 20% de FBS. cultivo tridimensional en perlas de alginato mantiene la viabilidad de las células de adenoma durante largos períodos de tiempo, hasta cuatro meses. Por otra parte, las células pueden ser liberados del alginato por lavado de las perlas con citrato de sodio y se sembraron en cubreobjetos de vidrio para análisis adicionales inmunocitoquímicos. El uso de un celmodelo l de cultivo permite la fijación y la visualización del citoesqueleto de actina con la desorganización mínima. En resumen, perlas de alginato proporcionan un sistema de cultivo fiable para el mantenimiento de las células adenoma hipofisario.
Introduction
Andamios tridimensionales se han utilizado ampliamente en el cultivo de células, ya que proporcionan un soporte estructural tridimensional para células cultivadas y el mantenimiento de la comunicación de célula a célula 1. materiales de polímero de origen natural se han utilizado para hacer los andamios tridimensionales incluyendo colágeno de tipo I, quitosano y alginato. El alginato es un polímero natural derivado de la Macrocystispyrifera algas de mar marrón (Kelp). Este polímero se compone de unidades repetidas de ácido β-D-manurónico (M) y α-L-gulurónico ácido (G) 2 y forma geles estables en presencia de ciertos cationes divalentes, tales como calcio y bario. Cloruro de calcio (CaCl 2) soluciones se utilizan comúnmente como el reactivo de reticulación para formar perlas de alginato. Soluciones de alginato se dejó caer en CaCl2 formar geles inmediatamente esféricas tridimensionales. Cuando la solución de alginato se mezcla con las células, las células se encapsulan en el alginato bEADS 3.
El alginato tiene propiedades que le han permitido para ser utilizado como una matriz para la encapsulación de una variedad de células, incluyendo condrocitos 4, mioblastos esqueléticos 5 y las células madre neurales 6. Es un material inerte y permite la difusión de nutrientes, oxígeno y productos metabólicos que mantienen la supervivencia y función de las células; por otra parte, a diferencia de otros sistemas de cultivo basados en gel, las células cultivadas en perlas de alginato también pueden ser liberados del andamio usando quelantes de calcio, tales como citrato de sodio, y las células entonces pueden ser cosechadas para investigaciones posteriores 7.
Los adenomas hipofisarios son tumores benignos generalmente con bajas tasas de proliferación. Líneas celulares de adenoma hipofisario rata han sido cultivadas con éxito en un sistema de dos dimensiones 8. Sin embargo, esta cultura de los tumores de células secretoras pituitaria humana no es un desarrollo eficiente; células de la pituitaria tumores crecen muy poco dispersasen cultivo, las células exhiben unión limitada y difusión, y las células normalmente forman agregados flotantes en la placa de cultivo 9,10.
Se han hecho varios intentos para obtener una suspensión de células de pituitaria tumor, incluyendo un enfoque enzimática y dispersión mecánica 11, un enfoque de dispersión exclusivamente mecánico 12 y el cultivo de explantes tumorales 10. Con estos enfoques, diferentes autores han obtenido cultivos adherentes viables para diferentes períodos de tiempo. Las capacidades de las células secretoras tumor para sobrevivir en estos sistemas bidimensionales dependerá del tipo de tumor y sus tasas de proliferación 9. Sin embargo, en cultivos a largo plazo, las células con fenotipos de fibroblastos predominan 11,13. Este documento describe un método para obtener un cultivo primario de células de adenoma de la pituitaria encapsuladas en perlas de alginato que los libera más lejos de la andamio alginato que permite el análisis detallado deaspectos de su biología celular, por ejemplo, sus arreglos del citoesqueleto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo tiene varios pasos críticos. La primera es la homogeneidad del tamaño del grano, que se requiere para mantener las mismas condiciones de difusión de los nutrientes y gases en todo el cultivo de células. En nuestra experiencia, el uso de una aguja de 21 G para hacer las perlas de alginato permite la adquisición de una cultura eficiente de tamaño uniforme de talón. El segundo factor importante es la distancia desde la aguja; esta distancia debe ser no más de 5 cm de la solución de calcio para evita…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
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