Tredimensionell alginat-pärla Culture of Human hypofysadenom Cells
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
En tredimensionell odling metod beskrivs i vilken primära hypofysadenom celler odlas i alginatpärlor. Alginat är en polymer härledd från brunt havsalger. Kortfattat är den tumörvävnad skars i små bitar och utsattes för en enzymatisk digerering med kollagenas och trypsin. Därefter görs en cellsuspension erhålles. Tumörcellsuspension blandas med 1,2% natriumalginat och droppades i en CaCl2-lösning, och den alginat / cellsuspensionen gelas vid kontakt med den CaCl2 för att bilda sfäriska pärlor. Cellerna inbäddade i alginatpärlorna levereras med näringsämnen som tillhandahålls av odlingsmedier berikade med 20% FBS. Tredimensionella kultur i alginatpärlor upprätthåller livskraften hos adenom cellerna under långa tidsperioder, upp till fyra månader. Dessutom kan cellerna frigöras från alginatet genom tvättning av pärlorna med natriumcitrat och såddes på täckglas för ytterligare immunocytokemiska analyser. Användningen av ett cell kulturmodell möjliggör för fixering och visualisering av aktin cytoskelettet med minimal oordning. Sammanfattningsvis alginatpärlor ge en tillförlitlig kultursystem för underhåll av hypofysadenom celler.
Introduction
Tredimensionella ställningar har i stor utsträckning använts i cellodling eftersom de ger ett tredimensionellt strukturellt stöd till odlade celler och upprätthållandet av cell-till-cellkommunikation 1. Naturligt framställda polymermaterial har använts för att göra tredimensionella ställningar inklusive typ I-kollagen, kitosan och alginat. Alginat är en naturlig polymer som härrör från bruna havsalger Macrocystispyrifera (Kelp). Denna polymer är sammansatt av upprepade enheter av β-D-mannuronsyra (M) och α-L-guluronsyra (G) 2 och bildar stabila geler i närvaro av vissa divalenta katjoner, såsom kalcium och barium. Kalciumklorid (CaCl2) lösningar är allmänt använda som tvärbindningsreagens för att bilda alginatpärlor. Alginatlösningar sjönk i CaCl2 omedelbart bilda tredimensionella sfäriska geler. När alginatlösningen blandas med celler, cellerna inkapslade i alginat beads 3.
Alginat har egenskaper som har gjort det möjligt att användas som en matris för inkapsling av en mängd olika celler, inklusive kondrocyter 4, skelett myoblaster 5 och neurala stamceller 6. Det är ett inert material och tillåter diffusion av näringsämnen, syre och metaboliska produkter som upprätthåller cellens överlevnad och funktion; Dessutom, till skillnad från andra gelbaserade odlingssystem, celler odlade i alginatpärlor kan också frigöras från ställningen med användning av kalcium kelatorer, såsom natriumcitrat, och cellerna kan sedan skördas för fortsatta undersökningar 7.
Hypofysadenom är typiskt godartade tumörer med låga proliferationshastigheter. Råtta hypofysadenom cellinjer har framgångsrikt odlas i ett två-dimensionellt system 8. Men är denna kultur av sekretoriska hypofys celltumörer mänskliga inte en effektiv utveckling; spridda tumör hypofysceller växer dåligti kultur, cellerna uppvisar begränsad vidhäftning och spridning, och cellerna bildar typiskt flytande aggregat i odlingsskålen 9,10.
Flera försök har gjorts för att erhålla en tumör hypofys cellsuspension, innefattande en enzymatisk och mekanisk dispersion tillvägagångssätt 11, en uteslutande mekanisk dispersion tillvägagångssätt 12 och odlingen av tumör explants 10. Med dessa metoder har olika författare erhållna livskraftiga vidhäftande kulturer för olika tidsperioder. Kapaciteten hos tumör sekretoriska celler att överleva i dessa tvådimensionella system beror på tumörtyp och deras förökningshastigheter 9. Men i långsiktiga kulturer, celler med fibroblaster fenotyper dominerar 11,13. Detta dokument beskriver en metod för att erhålla en primär kultur från hypofysadenom celler inkapslade i alginat pärlor som ytterligare frigör dem från alginat klätterställning som möjliggör detaljerade analyser avaspekter av deras cellbiologi, t.ex. deras cytoskelettala arrangemang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll har flera viktiga steg. Den första är pärlstorlek homogenitet, som krävs för att bibehålla samma villkor för diffusion av näringsämnen och gaser i hela cellkulturen. I vår erfarenhet, användning av en 21 G nål för att göra alginatpärlorna möjliggör för förvärv av en effektiv kultur av enhetlig pärlstorleken. Den andra viktiga faktorn är avståndet från nålen; detta avstånd får inte vara mer än 5 cm från kalciumlösningen för att undvika deformerade pärlor och döda celler p?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
