La culture tridimensionnelle dans des billes d’alginate, en raison de sa simplicité et de sa reproductibilité, a été choisie pour maintenir les cellules de l’adénome hypophysaire. Les procédures comprenaient une digestion enzymatique initiale et une dissociation mécanique du tissu tumoral, et la suspension cellulaire ultérieure a été encapsulée dans des billes d’alginate.
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Article de méthode
Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un procédé de culture en trois dimensions est décrit dans lequel les cellules d'adénome hypophysaire primaire sont cultivées dans des billes d'alginate. L'alginate est un polymère dérivé d'algues brunes de la mer. En bref, le tissu tumoral est coupé en petits morceaux et soumis à une digestion enzymatique avec de la collagénase et de trypsine. Ensuite, une suspension cellulaire est obtenue. La suspension de cellules tumorales est mélangé avec de l'alginate de sodium à 1,2% et est tombé dans une solution de CaCl 2, et la suspension d'alginate / cellule est gélifiée au contact du CaCl 2 pour former des billes sphériques. Les cellules incluses dans les billes d'alginate sont alimentées en nutriments sont fournis par des milieux de culture enrichi avec 20% de FBS. culture tridimensionnelle dans des billes d'alginate maintient la viabilité des cellules d'adénome pendant de longues périodes de temps, jusqu'à quatre mois. En outre, les cellules peuvent être libérés de l'alginate par lavage des billes avec du citrate de sodium et ensemencées sur des lamelles en verre pour d'autres analyses immunocytochimiques. L'utilisation d'une cell modèle de culture permet la fixation et la visualisation du cytosquelette d'actine avec désorganisation minimal. En résumé, des billes d'alginate fournissent un système de culture fiable pour le maintien de cellules hypophysaires adénome.
Introduction
Échafaudages tridimensionnels ont été largement utilisés dans la culture de cellules, car ils fournissent un support structural tridimensionnel de cellules mises en culture et le maintien de la cellule à cellule communication 1. des matières polymères d'origine naturelle ont été utilisés pour fabriquer des échafaudages tridimensionnels dont collagène de type I, le chitosane et l'alginate. Alginate est un polymère naturel dérivé de l'algue Macrocystispyrifera de mer brune (varech). Ce polymère est composé d'unités répétées de β-D-mannuronique (M) et α-L-guluronique (G) 2 et forme des gels stables en présence de certains c....
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Protocole
Cette étude a été approuvé pour l'utilisation de matériel humain par les comités d'éthique locaux de l'institution médicale et le Centre de recherche et Advance études de l'Institut National Polytechnique.
Acquisition de l'échantillon 1. tumorale
- Obtenir la biopsie de tissu hypophysaire adénome d'un patient grâce à une intervention chirurgicale trans-sphénoïdal 14.
- Recueillir l'échantillon hypophyse adénome et le placer dans une bouteille en verre stérile contenant 50 ml de frais 199 milieu de culture (M199) enrichi avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 0,6 mg / bicarbonate de s....
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Résultats
Ce protocole a été appliqué avec succès dans la culture et l'entretien des cellules hypophysaires adénome dans des billes d'alginate pour différentes périodes de temps Figure 1 montre les cellules incorporés dans des billes d'alginate au bout de trois mois. Ces cellules présentent des formes arrondies bi-réfringent sous un microscope optique inversé (figure 1). La figure 2 montre la localisation de la N-cadhérine dans les cel.......
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Discussion
Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est la taille homogénéité bourrelet, qui est nécessaire pour maintenir les mêmes conditions de diffusion des nutriments et des gaz dans l'ensemble de la culture cellulaire. Dans notre expérience, l'utilisation d'une aiguille de 21 G pour rendre les perles d'alginate permet l'acquisition d'une culture efficace de taille uniforme de perles. Le deuxième facteur important est la distance entre l'aiguille; cette distance ne doit pas être.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions M. O. Rios pour son assistance technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| fort ; | |||
| 199 Milieu de culture ; | Invitrogen ; | 31100-027 | Pour la culture, chaud dans un 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Sérum fœtal bovin ; | PAA | A15-751 | |
| Bicarbonate de sodium (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N&aigu ;-2éthanesulfonique (HEPES) | Sigma ; | H-4034 | |
| Pénicilline/Streptomycine | PAA | P11-010 | |
| PBS (solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco) | Invitrogen ; | 21600-044 | |
| Collagénase de type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsine ; | Invitrogen ; | 27250-018 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Inhibiteur de la trypsine de sorbène ; | Invitrogen ; | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Acide alginique, de Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma ; | A-2158 | |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Citrate de sodium (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Pipérazine-N,N&prime ;-bis(2-éthanesulfonique) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyéthylène glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Éthylène acide tétraacétique glycol (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Sulfate de magnésium (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldéhyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | |
| d’ammonium (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Sérum bovin Albumine sans IgG | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloïdine&ndash ; Isothiocyanate de tétraméthylrhodamine B | Sigma | P1951 | Toxique. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole, chlorhydrate (DAPI) | Invitrogen ; | D1306 | Toxique. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| Acide sulfurique (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Très corrosif. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| Hydroxyde de sodium (NAOH) | Merck | 1.06498 | Peut provoquer une irritation des yeux et de la peau. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; |
| (3-aminopropyl)triéthoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Bromhydrate de poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Bleu de trypan solution | Sigma | T8154 ; | |
| fort ; ; | Company ; | Numéro de catalogue ; | Comments |
| Equipment ; | Toxique : Peut causer le cancer. Utilisez des gants pour manipuler ce réactif ; | ||
| Rotateur ; | Centrifugeuse Boekel Scientific | modèle 230300 | |
| DuPont Corporation ; | Modèle sorvall TC6 | ||
| shaker ; | Instruments de laboratoire | Modèle 314-820²� ; |
Références
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
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