İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Üç boyutlu bir kültür yöntemi tarif edildiği primer hipofiz adenomları hücreleri aljinat taneleri yetiştirilir. Aljinat kahverengi deniz yosunu elde edilen bir polimerdir. Kısaca, tümör dokusu küçük parçalar halinde kesilmiş ve kolajenaz ve tripsin ile enzimatik sindirme sunulur. Daha sonra, bir hücre süspansiyonu elde edilir. Tümör hücre süspansiyonu% 1.2 sodyum alginat ile karıştırılmış ve bir CaCl2 solüsyonu içine düştü ve aljinat / hücre süspansiyonu küresel boncuklar oluşturmak üzere CaCI2 ile temas halinde jelleştirilmiş olmasıdır. Aljinat taneleri gömülü hücreleri,% 20 FBS ile zenginleştirilmiş kültür ortamı tarafından sağlanan besin sağlanır. aljinat taneleri üç boyutlu kültürü dört ay kadar uzun bir süre için adenom hücrelerin canlılığını muhafaza eder. Ayrıca, hücreler, sodyum sitrat olan boncuk yıkayarak alginat açığa çıkartılır ve daha immünositokimyasal analizler için cam lameller üzerine tohumlanabilir. Bir cel kullanımıl kültür modeli asgari örgütsüzlük ile aktin hücre iskeletinin fiksasyon ve görselleştirme için izin verir. Özet olarak, aljinat taneleri pituiter adenoma hücrelerinin bakımı için güvenilir bir kültür sistemi sağlar.
Introduction
Bunlar kültür edilmiş hücreler için üç boyutlu bir yapısal destek ve hücreden hücreye iletişimde 1 bakımını sağlamak için, üç boyutlu iskele kapsamlı hücre kültürü kullanılmıştır. Doğal olarak elde edilmiş polimer malzemeleri, tip I kollajenin, kitosan ve alginat da dahil olmak üzere, üç boyutlu bir yapı iskelesi yapmak için kullanılmıştır. Aljinat kahverengi deniz yosunu Macrocystispyrifera (deniz yosunu) elde edilen doğal bir polimerdir. Bu polimer β-D-mannuronik asit (M) ve α-L-guluronik asit (G), kalsiyum ve baryum gibi bazı iki değerli katyonların mevcudiyetinde 2 ve şekiller stabil jeller tekrarlanan birimlerden oluşur. Kalsiyum klorür (CaCI2) çözeltileri yaygın olarak, aljinat tanelerini oluşturmak üzere çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Aljinat çözeltiler hemen üç boyutlu küresel jel oluşturmak CaCI2 düştü. alginat çözeltisi hücreleri ile karıştırılır, hücreler aljinat B içine kapsüllenirEADS 3.
Aljinat sağlamıştır olan özellikleri kondroitler 4 iskelet miyoblastların 5 ve nöral kök hücreler 6 da dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli kapsüllenmesi için bir matris olarak kullanılmak zorundadır. Bu inert bir malzemedir ve besin, oksijen ve hücre yaşamını ve işlevini korumak metabolik ürünlerin dağıtılması için; Üstelik, diğer jel esaslı kültür sistemleri farklı olarak, aljinat taneleri içinde kültürlenmiş hücreler aynı zamanda, sodyum sitrat, kalsiyum şelatlar kullanılarak iskele serbest bırakılabilecektir ve hücreler daha sonra daha ileri araştırmalar 7 hasat edilebilir.
Hipofiz adenomları tipik olarak düşük çoğalma oranları ile iyi huylu tümörlerdir. Fare hipofiz adenomları hücre çizgileri, iki boyutlu bir sistemin 8 başarılı kültürlenmiştir. Ancak, salgı insan hipofiz hücre tümörlerinin bu kültür verimli bir gelişme değildir; dağınık tümör hipofiz hücrelerinin zayıf büyüyecekkültürde hücreler yayılan sınırlı eki ve sergilemek ve hücreler genellikle kültür çanak 9,10 yüzen agregatlar oluştururlar.
Birçok deneme enzimatik ve mekanik dispersiyon yaklaşım 11, salt mekanik bir dispersiyon yaklaşım 12 ve tümör eksplantlannın 10 kültür de dahil olmak üzere, bir tümör hipofiz hücresi süspansiyonu elde etmek için yapılmıştır. Bu yaklaşımlar ile farklı yazarlar farklı zaman aralıklarında için geçerli yapışık kültürleri elde edilmiştir. Tümör hücrelerinin salgı kapasiteleri tümör tipi ve üremeleri oranları 9 bağlıdır, bu iki boyutlu sistemlerde hayatta kalmak için. Ancak, uzun vadeli kültürlerde, fibroblast fenotipleri ile hücreleri 11,13 hakim. Bu makale ayrıca analizleri sağlayan alginat iskele onları açığa aljinat tanelerinde kapsüllenmiş hipofiz adenomları hücrelerinden bir birincil hücre elde edilmesi için bir yöntem tarif ederkendi hücre biyolojisi, örneğin, kendi iskelet düzenlemelerin yönleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol pek çok kritik adımlar vardır. İlk hücre kültürünün tüm besinler ve gazların difüzyonu aynı koşullar korumak için gerekli olan boncuk büyüklüğü homojenliği vardır. Bizim tecrübelerimize göre, aljinat boncuk yapmak için bir 21 G iğne kullanımı üniforma boncuk boyutu verimli bir kültür edinimi için izin verir. İkinci önemli faktör iğne mesafedir; Bu mesafe, kalsiyum çözeltisinden 5 cm kalsiyum çözeltisinin yüzeyinde ile aljinat / hücre çözümü akışı çarpışmas?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M.W., Anseth, K.S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. In: Carbohydrate chemistry : Volume 37. Rauter, A.P., Lindhorst, T.K. eds., Royal Society of Chemistry, 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-51 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D.J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E.K., Singh, A., Kipke, D.R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W.R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian Jr, A. H. Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I.,et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler,P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S.E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O.A., Marrs, R.P., Rundall, T.T., Weiss, M.H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H.E., Hershman, J.M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403- 408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L.M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. In: Measuring cell adhesion. Curtis, A. S.G., Lackie, J.M. eds., John Wiley & Sons, 110-111 (1991).
- Guiraud, J.M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L., Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
