Ce protocole décrit la digestion enzymatique de la peau de souris dans un milieu riche en nutriments, suivie d’une séparation par gradient pour isoler les leucocytes. Les cellules ainsi dérivées peuvent être utilisées pour diverses applications en aval. Il s’agit d’une alternative efficace, économique et améliorée aux machines de dissociation des tissus et aux protocoles de digestion tissulaire basés sur la trypsine et la dispase.
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Article de méthode
Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient
Dans cet article
Résumé
Résumé
La dissociation de la peau murine en une suspension unicellulaire est essentielle pour l’analyse cellulaire en aval, telle que la caractérisation des cellules immunitaires infiltrantes dans des modèles de rongeurs de l’inflammation cutanée. Ici, nous décrivons un protocole pour la digestion de la peau de souris dans une solution riche en nutriments avec de la collagénase D, suivie de la séparation des cellules hématopoïétiques à l’aide d’un gradient de densité discontinu. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées pour des études in vitro, des transferts in vivo et d’autres analyses cellulaires et moléculaires en aval, y compris la cytométrie en flux. Ce protocole est une alternative efficace et économique aux dissociateurs mécaniques coûteux, aux colonnes de séparation spécialisées et aux méthodes de digestion plus sévères à base de trypsine et de dispase, qui peuvent compromettre la viabilité cellulaire ou la densité des protéines de surface pertinentes pour la caractérisation phénotypique ou la fonction cellulaire. Comme le montrent nos données représentatives, ce protocole a produit des cellules hautement viables, contenait des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires et n’a eu aucun effet sur l’intégrité des protéines marqueurs de surface courantes utilisées dans l’analyse cytométrique en flux.
Introduction
Affections de la peau allant de la dermatite de contact, l'eczéma, le psoriasis, la cellulite, les infections fongiques et les abcès à des cancers de la peau non-mélanome ont été trouvés à être parmi les 50 maladies les plus répandues dans le monde, et la quatrième cause mondiale des maladies non mortelles en 2010 1. En conséquence, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents pathologies cutanées diverses est une zone nécessaire et actif de la recherche. Des modèles de rongeurs ont été remarquablement utiles pour la compréhension des maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique 2, 3 p....
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Protocole
Remarque: souris 8-12 semaine vieille femme ND4 Swiss Webster, classiquement hébergés avec un accès libre à la nourriture et de l'eau, ont été utilisées pour ces études Le protocole expérimental utilisé (B13S1) a été approuvé par IACUC de Macalester College..
1. Sensibilisation et Challenge Oxazolone
- Jour 0
- Préparer chambre anesthésie par addition de 3 ml d'isoflurane serviettes absorbantes placées sous maille au fond d'un couvercle 4 bocal en verre G. Pour la souris femelles ND4 utilisé ici, le temps dans la chambre est de 30 à 60 secondes jusqu'à ce que le sujet est correctement anesthésiés; optimiser l'admin....
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Résultats
La collagénase D splénocytes traités présentent des niveaux similaires de CD4 et CD8 α sur les cellules T par rapport aux témoins traités médias
Tout d'abord, les effets potentiels de la collagénase D sur la fréquence et la surface de la lignée et l'abondance des marqueurs d'activation sur des sous-ensembles de cellules T ont été évalués en utilisant le tissu lymphoïde secondaire en tant que témoin. Une suspension de s.......
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Discussion
La caractérisation des changements dans les leucocytes de la peau résident dans des modèles de rongeurs de maladies de peau telles que la dermatite atopique ou le psoriasis est important pour la compréhension de connexions mécaniques entre les afflux de cellules inflammatoires et la pathologie de la maladie. Nous décrivons ici une technique économique pour isoler des leucocytes à partir du tissu de la peau avec l'équipement de base dans la plupart des laboratoires de recherche biomédicale. Cette technique relativeme.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont aucun intérêt financier ou autre à divulguer.
Remerciements
Le National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 à DC), l'Association nationale Vulvodynia (prix à DC), et Macalester College soutenu ce travail. CB a reçu une bourse du Programme de Beckman Scholars Macalester College, financé par la Fondation Arnold et Mabel Beckman. BTF et TM sont pris en charge par la FRDJ 2-2011-662. Nous remercions le Dr Jason Schenkel et le Dr Juliana Lewis pour obtenir des conseils techniques, et tous les membres actuels et anciens du laboratoire Chatterjea pour leur aide et leur soutien.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| HBSS au rouge de phénol, sans calcium, sans magnésium, liquide | Sigma Aldrich | 55021C | Conserver stérile jusqu’au jour de l’utilisation. |
| HEPES, &ge ; 99,5 % (titrage) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA solution de sel disodique | Sigma Aldrich | E7889 | Conserver stérile jusqu’au jour de l’utilisation. |
| Sérum fœtal bovin, USDA, Inactivé par la chaleur, Premium Select | MidSci | S01520HI | Conserver stérile jusqu’au jour de l’utilisation. |
| Percoll, pH 8,5-9,5 (25° ; C) | Sigma Aldrich | P1644 | Conserver stérile. Percoll doit être rendu isotonique avec du PBS 10X stérile avant utilisation. |
| Kit combo de tondeuse | Kent Scientific | CL9990-1201 ; | Utilisez la plus grande tondeuse pour raser le flanc et le dos. |
| 4-éthoxyméthylène-2-phényl-2-oxazoline-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissoudre dans 100 % EtOH à 50° ; C pendant 15 minutes sur une plaque tournante. |
| Purifié anti-souris CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Anticorps utilisé pour bloquer la liaison d’anticorps non spécifiques lors de la coloration d’anticorps pour la cytométrie en flux |
| anti-CD3&epsilon ;-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour l’écoulement cytométrie |
| anti-CD8&alpha ;-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| Anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Colorant de viabilité pour la cytométrie en flux |
| LSR Fortessa Fortton | Dickinson | N/A | Analyseur de cellules (18 paramètres) |
| Collagénase D de Clostridium histolyticumRoche | Applied Science | 11088858001 | Enzyme lyophilisée aliquote à 5 mg/ml dans HBSS avec du rouge de phénol, sans calcium et sans magnésium dans des aliquotes de 1 mL. Conserver immédiatement à -20° ; C pour une période maximale de six mois. |
| ND4 Souris femelles suisses | Harlan | 0-32 | 8-12 semaines ; logé de manière conventionnelle avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau et utilisé conformément aux directives IACUC du Macalester College. |
Références
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K.
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Réimpressions et autorisations
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