Isolering av infiltrerende Leukocytter fra Mouse Skin Bruke Enzymatisk Digest og Gradient Separation

Summary

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Abstract

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Introduction

Hudsykdommer som spenner fra kontakteksem, eksem, psoriasis, cellulitt, soppinfeksjoner og abscesser til ikke-melanom hudkreft ble funnet å være blant de 50 mest utbredte sykdommer over hele verden, og den fjerde ledende global årsak til ikke-dødelige sykdommer i 2010 ^en. Følgelig er undersøkelse av molekylære og cellulære mekanismer som ligger under forskjellige hud patologier en nødvendig og aktivt forskningsområde. Gnagermodeller har vært bemerkelsesverdig nyttig i forståelsen av inflammatoriske hudsykdommer som atopisk dermatitt ^2, psoriasis ^3, eller Staphylococcus aureus infeksjon ^4. Billige, effektive og enkle protokoller for den enzymatiske fordøyelse av musehud vev kan tilveiebringe preparater av celler som kan brukes for en rekke forskjellige anvendelser nedstrøms for bedre å forstå patofysiologien av hudsykdommer. Her er en enkel og økonomisk metode beskrevet for enzymatisk sammendrag av mus hudvev og isolering av hud infiltrerende leukocytter som kan anvendes for cellekultur, in vivo adoptiv overføring, flowcytometrisk analyse og sortering eller genuttrykkstudier. Det overordnede målet med denne prosedyren er å forberede en enkelt celle suspensjon av hud-infiltrerende leukocytter med høy celleviabilitet samtidig minimere kostnader vanligvis forbundet med tilpassede reagenser og mekaniske dissociators.

Eksisterende huden vev dissosiasjon metoder ^5-7 kan føre til lav celle levedyktighet og overflate markør integritet, eller krever tilpassede enzym kits og dyre vev dissosiasjon maskiner ^8-11. Mens spaltning av museøre hudvev er rimelig utbredt ^12-13, bearbeider sterkt keratiniserte hudvev (for eksempel fra flanken) kan resultere i cellepreparater som er forurenset med store mengder av ikke-cellulært avfall. I en fersk undersøkelse, Zaid og kolleger fordøyd mus flanke huden i 90 minutter i 2,5 mg / ml dispase, folloonsdag etter 45 min i 3 mg / ml kollagenase ^7. I en annen studie disse forskerne anvendes flere inkuberinger med en kombinert fordøyelse av 2,5 timer, herunder bruk av trypsin / EDTA, kollagenase III, og dispase ^5. Bruken av trypsin er ikke anbefalt for enzymatisk fordøyelse hud, som behandling med trypsin fra forskjellige produsenter har vist seg å målbart påvirke integriteten av celleoverflateproteiner på pattedyrceller ^14-15. I tillegg kan dispase ha betydelige effekter på proliferative egenskaper av CD4-T-celler og CD8a og påvirke overflate mengde på minst 20 molekyler, inkludert vanlig T-celleaktivering markører slik som CD62L ^16. Andre protokoller bruke RPMI 1640 i fordøyelsen medium ^6. Imidlertid kan tilstedeværelsen av ^Mg2 + og ^Ca2 + i RPMI forårsake omfattende celle ¹⁷ aggregering.

En ideell protokoll for vev dissosiasjon bør satse på høy celle levedyktighet, lavnivåer av celle aggregering, og minimal skade på celleoverflateproteiner. Høy kvalitet lymfeknute stromal cellepreparater har blitt oppnådd med protokoller som bruker kortere enzym inkuberinger, Ca ²⁺ og Mg ²⁺ frie medier, og unngå trypsin og dispase ^18. Imidlertid protokoller av denne type er ikke blitt fastslått for dissosiasjon av hele musehud.

Her er en protokoll beskrevet å distansere, isolere og berike hud-infiltrerende leukocytter fra allergen-utfordret mus flanke huden. I korthet spaltet hud er pre-inkubert i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 10% føtalt bovint serum i 1 time for å myke vevet i fordøyelsen og fjerne overflødig død hud eller fettvev. Dette er etterfulgt av en 30 min enzymatisk digereringstrinnet med 0,7 mg / ml kollagenase D. Kollagenase D har minimale virkninger på tettheten av celleoverflatemarkører, og ingen virkning på T-celleformering in vitro ^16,18, slik at detsvært godt egnet for anvendelser som involverer karakterisering av overflateproteiner. Etter enzymatisk fordøyelse, ble diskontinuerlig tetthetsgradient sentrifugering brukes til å fjerne epitelceller og rusk fra enkeltcellesuspensjon og anrike for hematopoetiske celler. Viktigere, unngår denne prosedyre kostkolonnebasert magnetisk celleseparasjonsreagenser og vev dissosiasjon maskiner ^8-11, og kan utføres med utstyr og materialer som finnes i en grunnleggende laboratorie biomedisinsk forskning. Her denne protokollen ble brukt til å isolere leukocytter fra flanken huden utfordret tre ganger med haptenet oksazolon (Ox) i tidligere sensibilisert ND4 sveitsiske mus (tilpasset fra 19). Celler ble analysert ved hjelp av multi-parametriske flowcytometri. Denne teknikk ga en cellesuspensjon med minimalt avfall og> 95% levedyktigheten av isolerte lymfocytter som ble analysert ved hjelp av multi-parametriske strømningscytometri for å måle infiltrasjon av T-lymfocytter og neutrofiler inn i det berørte ski.

Protocol

Merk: 8-12 uker gammel kvinnelig ND4 sveitsiske Webster mus, konvensjonelt plassert med fri tilgang til mat og vann, ble brukt for disse studiene Den eksperimentelle protokollen som brukes (B13S1) ble godkjent av Macalester College IACUC.. 1. Sensibilisering og Challenge med oksazolon Dag 0 Forbered anestesi kammeret ved å tilsette 3 ml isofluran absorberende håndklær plasseres under mesh på bunnen av en 4 L lokk glasskrukke. For ND4 hunnmus anvendt her, tid i kammeret er 30-60 s…

Representative Results

Kollagenase D behandlet splenocytter viser tilsvarende nivåer av CD4 og CD8 T-celler på α i forhold til medie-behandlede kontroller Først ble en eventuell skadelig virkning av kollagenase D på frekvens og overflate overflod av avstamning og aktivisering markører på T-celle undergrupper vurdert ved hjelp av sekundær lymfevev som kontroll. En suspensjon av splenocytter ble oppnådd fra ND4 mus og vasket i 1 …

Discussion

Karakteriserende endringer i hud-resident leukocytter i gnagermodeller av hudsykdommer slik som atopisk dermatitt eller psoriasis er viktig for å forstå mekaniske forbindelser mellom inflammatorisk celleinnstrømning og sykdomspatologien. Her beskriver vi en økonomisk teknikk for å isolere leukocytter fra hudvev med grunnleggende utstyr som finnes i de fleste biomedisinske forskningslaboratorier. Denne relativt raske teknikken unngår bruk av dyre vev dissosiasjon maskiner og tilpassede rør og reagenser, bidrar til…

Materials

HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid	Sigma Aldrich	55021C	Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA disodium salt solution	Sigma Aldrich	E7889	Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select	MidSci	S01520HI	Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C)	Sigma Aldrich	P1644	Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one	Sigma Aldrich	E0753-10G	Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3e-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8a-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice	Harlan	0-32	8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines.