Améliorer 2D et 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

Résumé

Nous présentons un protocole pour obtenir des matrices dérivées de cellules riches en protéines de la matrice extracellulaire, en utilisant Crowders macromoléculaires (MMC). En outre, nous présentons un protocole qui incorpore MMC dans organotypique génération de co-culture de la peau 3D, ce qui réduit le temps de la culture tout en maintenant la maturité de la construction.

Résumé

La famille des collagènes glycoprotéine représente les principales protéines structurales dans le corps humain, et sont des composants essentiels de biomatériaux utilisés dans l'ingénierie tissulaire moderne. Un goulot d' étranglement technique est le dépôt de collagène in vitro, comme il est notoirement lent, entraînant une sous-optimale la formation du tissu conjonctif et de la cohésion du tissu ultérieur, en particulier dans les modèles de peau. Ici, nous décrivons un procédé qui comprend l'addition de co-polymères de saccharose différentiellement taille des cultures de peau pour générer entassement macromoléculaire (CMM), qui se traduit par une amélioration spectaculaire du dépôt de collagène. En particulier, des fibroblastes dermiques déposé une quantité importante de collagène de type I / IV / VII et de la fibronectine sous MMC par rapport aux témoins.

Le protocole décrit également un procédé pour decellularize couches de cellules encombrées, exposant ainsi des quantités importantes de la matrice extracellulaire (ECM) qui ont été retenus sur la surface de culture comme en témoigne immunocytochemistry. motif total de masse et la distribution matrice a été étudiée en utilisant la microscopie interférence de réflexion. matrices intéressant, les fibroblastes, les kératinocytes et les co-cultures produites dérivées de cellules (MDP) de la composition et de la morphologie variable. MDP pourrait être utilisé comme «bio-échafauds» pour l'ensemencement des cellules secondaire, où l'utilisation actuelle des revêtements ou échafauds, généralement à partir de sources animales xénogéniques, peut être évité, déplaçant ainsi vers plus cliniquement pertinente des applications.

En outre, ce protocole décrit l'application de MMC pendant la phase immergée d'une peau modèle 3D organotypique co-culture qui était suffisant pour améliorer le dépôt de l'ECM dans la jonction dermo-épidermique (JDE), en particulier le collagène VII, le composant majeur des fibrilles d'ancrage. La microscopie électronique a confirmé la présence de fibrilles d'ancrage sur des cultures développées avec MMC, par rapport aux témoins. Cela est important car fibrilles d'ancrage d'attache du derme à l'épiderme, par conséquent,ayant une maturité DEJ préformé peut bénéficier receveurs de greffe de la peau en termes de stabilité du greffon et la guérison globale de la plaie. En outre, le temps de la culture a été condensé de 5 semaines à 3 semaines pour obtenir une construction mature, lorsque vous utilisez MMC, en réduisant les coûts.

Introduction

La peau forme une barrière protectrice en empêchant la perte d'eau et de l'entrée de l'agent pathogène. Il est constitué de trois composants principaux; les stromales riches derme ^1, un épiderme stratifié ^2,3,4 sur le dessus de celui - ci, et la jonction dermo-épidermique entre ^5,6. Le derme est composé en grande partie de collagène et des fibres élastiques et est peu peuplé avec des fibroblastes ^7. En revanche, l'épiderme riches en cellules est composé de plusieurs couches de kératinocytes. Les kératinocytes de la couche interne, la plupart sont proliférative et fournissent de nouvelles cellules basales qui....

Protocole

1. macromoléculaire Surpeuplement en 2D des cultures de cellules de la peau

1. Seed 50.000 cellules (fibroblastes primaires ou des kératinocytes primaires ou co-culture de fibroblastes et kératinocytes primaires) par puits d'une plaque de 24 puits. cellules de semences dans 1 ml de milieu de croissance de type cellule correspondante.
2. Laisser les cellules adhérer pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO _2.
3. Jeter les anciens médias et le remplacer par 1 ml de milieu frais contenant Crowders macromoléculaires et 100 uM d'acide ascorbique. Utiliser un cocktail crowder constitué de 37,5 mg / ml de Fico....

Résultats

Encombrement macromoléculaire a pu améliorer le dépôt d'ECM, en particulier, les fibroblastes déposés plus de collagène I, IV et de la fibronectine par rapport aux cultures témoins (Figure 1, la couche cellulaire; 1A, le collagène I; 1B, le collagène IV, 1C, fibronectine). Sur décellularisation, il était évident que les fibroblastes étaient les principaux déposants de collagène I, IV et de la fibronectine par rapport.......

Discussion

La matrice extracellulaire améliorée est obtenue lors de l’introduction de crowders macromoléculaires dans la culture cellulaire, en raison de l’effet de volume exclu qui augmente le clivage du propeptide par les protéinases. Il en résulte que la matrice extracellulaire, en particulier le collagène, est traitée plus rapidement et se dépose à la surface de la culture. Alors que d’autres groupes ont obtenu d’épaisses couches de cellules de fibroblastes, cela a impliqué un temps de culture de plusieurs semaines²⁰.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide ascorbique	Wako	013-12061	Additif pour milieux de culture
cellulaire Inserts de culture cellulaire  ; (format à 6 puits)	Greiner Bio-One	657610	Cultures organotypiques
Solution de citrate	Dako	S2369	DakoCytomation Solution de récupération de cibles Citrate, pH 6 (x10)
Collagène (queue de rat)	Corning	354236	Cultures organotypiques
CnT-57	CELLnTEC	CnT-57	Milieux de culture cellulaire
DAB Substrat + kit chromogène	Dako	K3468	Histologie
Plaque à puits profonds (format 6 puits)	Corning	355467	Cultures organotypiques
Réactif de détection ECL	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Amersham ECL Western Blot Detection
Reagent Microscope électronique (TEM)	; JEOL  ;	; JEM-1010 (100kV)	Microscopie électronique à transmission
Média fibroblastique (FM)			High Glucose-DMEM + 10 % Sérum de bovin fœtal + 1 % de pénicilline Streptomycine
Ficoll PM70	GE Healthcare Life Sciences	17-0310-05	Crowder macromoléculaire
Ficoll PM400	GE Healthcare Life Sciences	17-0300-05	Crowder macromoléculaire
Milieu sans sérum de kératinocytes (KSFM)	Life Technologies	17005-042	Milieux de culture cellulaire
Tampon de lyse	ThermoFisher Scientific	89900	Tampon de lyse pour l’extraction des protéines. Un inhibiteur de protéase (Roche, #11836170001) a été ajouté à ce tampon de lyse.
Microscope	Zeiss	LSM510	Canaux rouges, verts et bleus pour visualiser les immunomarquages fluorescents AF594, AF488 et DAPI (40X mag).
Milieux de montage (Hydromount)	National Diagnostics	HS-106	Coloration fluorescente
Milieux de montage (Cytoseal)	ThermoFisher Scientific	8310-16	Histologie (HRP)
Composé OCT (Tissue Tek)	Sakura	4583	Enrobage pour cryotomie
Antibiotiques pénicilline-streptomycine	Sigma Aldrich	A5955	Additif de milieu de culture cellulaire
Anticorps primaires
Anticorps anti-collagène I	Abcam	#ab6308
Anti-collagène de type IV	Novocastra	#NCL-COLL-IV
Anti-collagène VII			LH7.2 (en interne)  ;
Anticorps anti-fibronectine	Abcam	#ab2413
Agent réducteur  ;	ThermoFisher Scientific	NP0009	Western blot
Tampon d’échantillon	ThermoFisher Scientific	NP0008	Western blot
Anticorps secondaires (immunomarquage)
4&prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Sigma Aldrich	#D9542
AlexaFluor 594 chèvre-anti-lapin	ThermoFisher Scientifique	#A-11037  ;
AlexaFluor 594 chèvre-anti-souris	ThermoFisher Scientific	;#A-11005
AlexaFluor 488 poulet-anti-lapin	ThermoFisher Scientific	#A-21441
AlexaFluor 488 chèvre-anti-souris	ThermoFisher Scientific	#A-11001
Anticorps secondaires (HRP)		Dako Envision + System - HRP Labellisé Polymère anti-lapin et anti-souris	désoxycholate de sodium non dilué
	Prodotti Chimicie Alimentari		Décellularisation
Milieu de stratification
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium  ;			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
Jambon s F12  ;   ;   ;			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
10 % de sérum fœtal bovin  ;			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
100 U/ml de pénicilline et 100 U/ml de streptomycine			Utilisés lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
0,4 mg/ml d’hydrocortisone			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
5 mg/ml d’insuline			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
1.8 et point moyen ; 10-4 M adénine  ;   ;			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
5 mg/ml de transferrine			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
2 et point moyen ; 10- 11 M de triiodothyronine  ;			Utilisé lors de l’interface air-liquide des cultures organotypiques. Ce milieu est ajouté à l’extérieur de l’insert de culture cellulaire.
Biopolis de trypsine	Installations partagées	0,125 % Trypsine/versène  ;   ; pH 7,0 + 0,3	Utilisé pour trypsiniser les cellules