Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray
Summary
Este protocolo descreve o fabrico de uma grande escala, o ADN ou o anticorpo matriz bidimensional multiplexado, com aplicações potenciais em estudos de sinalização de células e detecção de biomarcador.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Os microarrays de anticorpos têm sido amplamente usados em estudos de proteómica durante décadas para examinar a presença de proteínas-alvo, incluindo os biomarcadores da proteína 1-3. Embora esse campo está actualmente a enfrentar grandes desafios de outros tecnologias de alta capacidade, tais como espectrometria de massa (MS), ainda há muito espaço para o utilitário de microarrays de anticorpos, principalmente porque estes dispositivos proporcionam interpretação de dados simples e fácil de interface com outros ensaios. Nos últimos anos, a integração de microarrays para andaimes microchip forneceu o microarray anticorpo uma nova oportunidade para prosperar 4-7. Por exemplo, o micro-arranjo de código de barras integrado em um microchip de uma única célula foi usada em estudos de comunicação celular 8,9. Esta tecnologia tem vantagens distintas em relação a outras tecnologias de microarray disponíveis. Possui elementos de matriz em 10-100 mm, muito menor do que o 150 um tamanho típico usado em elemen microarray convencionaisTS. A construção dos elementos de matriz mais pequenas é conseguida utilizando abordagens de fluxo de padrões sistemáticos, e isto dá origem a microarranjos compactos que podem detectar as proteínas de célula única segregadas e proteínas intracelulares. Outra vantagem é o uso de uma configuração simples, livre de instrumento. Isto é particularmente importante, porque a maioria dos laboratórios e empresas de pequeno porte pode não ser capaz de acessar instalações nucleares microarray. Microarrays de anticorpo tal código de barras recurso avançado de ensaio de transferência e podem ser usados para realizar ensaios altamente multiplexados em células isoladas, enquanto alcançando alta sensibilidade e especificidade comparável com a do ensaio de imunossorvente ligado a enzima-sanduíche convencional (ELISA 8). Esta tecnologia tem numerosas aplicações na detecção de proteínas de 9-11 glioblastoma, células T 12, e as células tumorais circulantes 13. Como alternativa, DNA microarrays de códigos de barras só têm sido utilizados no posicionamento preciso de neurónios e astrócitos para Mimicking a montagem in vivo do tecido cerebral 14.
Este protocolo incide apenas sobre os passos experimentais e blocos acúmulo de o bidimensional (2-D) de código de barras anticorpo microarray que tem aplicações potenciais na detecção de biomarcadores em amostras de fluidos e em células individuais. A tecnologia baseia-se numa endereçável de cadeia simples, unidimensional (1-D) de microarranjo de DNA construído utilizando oligonucleótidos que são ortogonais modelado espacialmente em substratos de vidro. O padrão 1-D é formado quando os canais de fluxo paralelos são usados no passo de fluxo-padronização, e tal padrão aparece como bandas discretas visualmente semelhantes a 1-D Universal Product Code (UPC) de códigos de barras. A construção de um 2-D (n x m) matriz de anticorpo – reminiscente de um 2-D de Resposta Rápida (QR) de código matriz – necessita de estratégias de padrões mais complexos, mas permite a imobilização de anticorpos a uma densidade mais elevada 8,15. A fabricaçãorequer dois passos de modelação de ADN, com o primeiro padrão perpendicular ao segundo. Os pontos de intersecção destes dois padrões constituem os elementos de m x n da matriz. Ao seleccionar estrategicamente as sequências de ADN de cadeia simples (ssDNA) utilizado em fluxo-padronização, cada elemento de uma determinada matriz é atribuído um endereço específico. Esta referência espacial é necessário distinguir entre sinais de fluorescência no slide microarray. A matriz de ADNcs é convertido em uma matriz de anticorpo por meio da incorporação de conjugados ADN-anticorpo complementares, formando uma plataforma chamada biblioteca de anticorpos codificados por ADN (DEAL 16).
Este protocolo vídeo descreve os principais passos na criação de matrizes nxm de anticorpos que incluem a preparação de polidimetilsiloxano (PDMS) moldes código de barras, fluxo-padronização ssDNA em duas orientações, a preparação de conjugados anticorpo-DEAL de oligonucleotídeos, e converter a matriz 3 x 3 DNA em um 3x 3 matriz de anticorpo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Padrão de fluxo de concepção é o primeiro passo crítico na fabricação da micromatriz 2-D. Para gerar dois padrões de ADN que se sobrepõem sobre um substrato de vidro, as características do canal do primeiro design deve ser perpendicular às da segunda (Figura 1A-B). Os projetos também considerar as aplicações a jusante do microarray. No caso de análise de uma única célula, o micro-arranjo é utilizado para detectar proteínas a partir de células individuais e fechadas em microc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
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