Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon
Summary
Detta protokoll ger en metod för att utföra kvantitativ, encelliga in situ analys av proteinuttryck för att studera härstamning specifikation mus preimplantatorisk embryon. De förfaranden som krävs för insamling av blastocyster, hela montering immunofluorescens detektion av proteiner, är avbildning av prov på en konfokalmikroskop och kärnsegmentering och bildanalys som beskrivits.
Abstract
Detta protokoll ger en metod för att utföra kvantitativ, encelliga in situ analyser av proteinuttryck för att studera härstamning specifikation i mus preimplantatorisk embryon. De förfaranden som krävs för embryosamlings, immunofluorescens, avbildning på en konfokalmikroskop och bildsegmentering och analys beskrivs. Denna metod tillåter kvantifiering av uttrycket av multipla kärnmarkörer och den rumsliga (XYZ) koordinaterna för alla celler i embryot. Det drar nytta av min, en bild segmentering verktyg speciellt utvecklat för analys av konfokala bilder av preimplantatorisk embryon och embryonala stamcells (ESC) kolonier. MIN utför obevakad kärnsegmentering över X, Y och Z dimensioner och ger information om cellposition i tredimensionell rymd, liksom kärn fluorescens nivåer för alla kanaler med minimal användarinmatning. Även om detta protokoll har optimerats för att analysera bilderav preimplantatorisk skede musembryon, kan det lätt anpassas till analys av andra prover som uppvisar en bra signal-brusförhållande och där hög nukleär densitets utgör ett hinder för bildsegmentering (eg., uttryck analys av embryonala stamceller (ESC ) kolonier, differentierande celler i odling, embryon från andra arter eller steg, etc.).
Introduction
Musen preimplantationsembryot är ett paradigm för att studera uppkomsten och upprätthållandet av pluripotens in vivo, samt en modell för studier av cell öde specifikation och de novo epitelbildning hos däggdjur. Preimplantationsperioden utvecklingsstadier däggdjur är avsedda för fastställandet av de tre cellinjer som utgör blastocysten, nämligen pluripotenta epiblast – som ger upphov till de flesta somatiska vävnader och könsceller – och två extraembryonic härstamningar, trophectoderm (TE) och primitiv endoderm (PRE) (Figur 1A) 1,2. Detta protokoll beskriver förfaranden för att (1) skörd och fixa preimplantatorisk skede musembryon, (2) utför immunofluorescens att märka proteiner av intresse, (3) utföra hela montering avbildning med en konfokalmikroskop med z-sektione kapacitet och (4) utföra kärnsegmentering av konfokala bilder och efterföljande kvantitativa bild analyser. Denna pipeline möjliggör than objektiva mätningar av proteinnivåer för tilldelning av cellidentiteter till karakterisera subpopulationer av celler in situ. Detta protokoll kan utföras i så lite som 3-4 dagar för en enda kull (i allmänhet upp till 10 musembryon), från embryosamlings till dataanalysen (Figur 1B). Samtidig analys av flera kullar skulle öka avbildning och dataanalys annan belastar, och därigenom förlänga den totala längden av protokollet.
Preimplantationsperioden steget musembryo är en experimentellt lätthanterligt system som, med tanke på dess ringa storlek och stereotypa morfologi 3, är väl lämpad för in toto avbildning av cellulära processer med encelliga upplösning. För att utföra en opartisk analys systemnivå av en statistiskt relevant antal embryon, är önskvärt en automatiserad, kvantitativ pipeline analys. Emellertid, tack vare den höga kärndensitet av den inre cellmassan (ICM) av blastocysten ( <stRong> Figur 1A, 2D), konventionella bildsegmente plattformar inte ger tillräcklig noggrannhet för att upprätta en automatisk eller halvautomatisk arbetsflöde. Å andra sidan, manuell segmentering, medan korrekt, inte tillåter bearbetning av stora grupper av celler och embryon, inte heller är det lämpligt för en reproducerbar, objektiv bestämning av cellidentiteter – vilket är särskilt viktigt när man studerar utvecklingsstadier där mönster markör uttryck har inte helt löst (t.ex. inte uppvisar en binärdistribution över en befolkning). Vi har nyligen utvecklat och validerat en bild segmentemetod anpassad för mus preimplantatorisk skede embryon och för mus embryonala stamceller (ESC) som uppnår hög noggrannhet, samtidigt som den kräver minimal användarinmatning 4-8.
Rörledningen analys som presenteras här kretsar kring MATLAB-baserad bild segmentering verktyg Modular Interactive Nuclear Segmente (min) 4. MINS performs obevakad kärnsegmente på stora partier av konfokala Z-stackar efter att användaren har etablerat ett minimalt antal bildegenskaper, med hjälp av ett grafiskt användargränssnitt (GUI) (tabell 1) 4. Denna rörledning har visat sig vara effektiv för generering av hög kapacitet data om proteinuttryck och cell lokalisering i både vildtyp, experimentellt behandlade och genetiskt modifierade embryon och ESCs 5-7. I det nuvarande protokollet beskriver vi tillämpningen av minuter till segmentering av preimplantatorisk skede embryo bilder. För exempel på MINS prestanda på ESC hänvisas till 4,7. Den automatiserade kärnsegmente steg minskar avsevärt tiden bördan av cellidentifikationsprocessen, medan de rumsliga och fluorescensmätningar intensitet tillåter en opartisk bestämning av cellidentiteter och generering av tredimensionella kartor över genuttryck domäner och cellposition i embryot (Figur 1C </strong>). Dessutom skalbarheten detta arbetsflöde gör det som gäller för analys av enskilda kullar genom stora kohorter av experimentellt behandlade embryon, eller embryon från olika genetiska bakgrunder 5,6. MIN är fritt tillgänglig på http://katlab-tools.org (programmet kräver en MATLAB licens).
Ingen metod utvecklats hittills tillåter alstring av sådana djupgående uppgifter om proteinuttryck och cell lokalisering i mus preimplantatorisk embryon. Alla försök hittills på att kvantifiera dessa typer av data har begränsats till den manuella bestämning och kvantifiering av cellantal för olika populationer i embryot (antingen helt manuellt eller mjukvaru assisterad) 9-19. Detta tillvägagångssätt (införliva MINS programvara) har skräddarsytts för och testats på mus preimplantatorisk embryon och ESC; ändå dess prestanda på andra system med hög nukleär densitets, men ännu oprövad, förväntas vara likvärdig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuvarande protokollet beskriver en metod för att utföra en kvantitativ analys av hela montera immunofluorescens på preimplantatorisk skede musembryon. En robust immunofluorescens protokoll 22 följs av hög upplösning, hela montering konfokal avbildning och bildsegmentering med hjälp av en skräddarsydd mjukvara 4. Även valet av immunofluorescens-protokollet är inte kritisk, finner vi det som presenteras här 22 att vara snabb, pålitlig och att tillhandahålla robust signal f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.
Materials
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, overnight fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to overnight fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -. K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -. K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -. K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
