Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist weit verbreitet, um ein besseres Verständnis der Zellfunktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung 1 zu gewinnen. FRET wird Energie von einem angeregten Donor-Fluorophor mit einem Akzeptor-Fluorophor übertragen. FRET-Effizienz hängt stark von der Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor-Fluorophor und deren Ausrichtung und damit eine empfindliche Auslesen von Konformationsänderungen, welche die beiden Fluorophore beeinflussen. Dieses Phänomen wird genutzt, um FRET-Biosensoren für die Bildgebung von kleinen Molekülen zu erzeugen. Änderungen in deren Konzentration überwacht werden erhöht / verringert sich im Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors gegen Donorfluorophors 2. Zum Beispiel ermöglichen eine schnelle und stabile Erfassung von freien Calciumkonzentrationen in lebenden Zellen 3 FRET-basierten Biosensoren Calcium. Weitere Vorteile der FRET-Biosensoren sind in einzelnen lebenden Zellen Bildgebung, tErben Nichtinvasivität, ihrer Fähigkeit, an verschiedenen Zelltypen und Zellkompartimente 4 ausgerichtet sein.
Viele Aspekte der intrazellulären Gallensäure Dynamik noch weitgehend unverstanden. Zum Beispiel ist wenig über den Mechanismus zugrunde liegende Regelung von konjugierten und nicht konjugierten Gallensäure-Transport bekannt. Bestehende Techniken zur Überwachung dieser Transport vor allem nutzen Luciferase-basierte Reportern, radioaktiv markierte Gallensäuren oder fluoreszierenden Gallensäure-Analoga. Letztere erfordert eine Modifikation der Gallensäuren, gegebenenfalls deren Eigenschaften zu beeinflussen. Luciferase-basierte Reporter haben schlechte Zeitauflösung. Außerdem führen diese Techniken zu einem Verlust der Probe und nicht anwendbar für die Bildgebung in einzelnen Zellen. Daher wäre es von Vorteil, um Methoden, die Live-Single-Cell-Imaging von Speditionstätigkeit ermöglichen mit FRET Biosensoren nutzen, zumal es beinhaltet den Vorteil, ratiometrische Detektion 5, 6. Während Varianten von CFP / YFP Form am häufigsten verwendeten FRET-Paare, neue Strategien durch MORANGE und mCherry tragenden Selbstassoziation induzierenden Mutationen zu einer Ausdehnung des FRET-Toolbox mit neuartigen Sensoren, einschließlich eines rotverschoben Gallensäuresensor 7 geführt.
Wir eine genetisch kodierte FRET Gallensäuresensor (BAS), das aus einem Donor-Fluorophor (himmel) und einem Akzeptor-Fluorophor (Citrine), die mit dem Farnesoid X-Rezeptor (FXR) Liganden-Bindungsdomäne fusioniert sind, besteht eine zuvor (FXR-LBD) und ein Peptid, das ein LXXLL-Motiv 8. Dieses Peptid assoziiert mit dem FXR-LBD in einem Gallensäure-abhängige Weise. Nach FXR-Aktivierung wird die Distanz zwischen Citrin und cerulean ändern aufgrund einer Konformationsänderung. In Säugetierzelllinien, FXR-Aktivierung führt zu einer deutlich spürbaren Erhöhung der Citrine / cerulean Verhältnis, während das gereinigte Sensor arbeitet in entgegengesetzter Richtung und führt zu einer verringerten FRET Verhältnis auf FXR-Aktivierung. Dieser Sensor (CytoBAS)ermöglicht die Überwachung von zytosolischen Gallensäure-Dynamik. Durch Carboxy-terminale Addition von subzellulären Targeting-Motive kann der BAS-Konstrukts in den Zellkern (NucleoBAS) und Peroxisomen (PeroxiBAS) ausgerichtet werden, so dass Messungen der Gallensäure-Konzentrationen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Obwohl die Zugabe des peroxisomalen Targeting-Motiv nicht seiner Anpassungsfähigkeit an Gallensäuren zu beeinträchtigen, hat zellpermeablen FXR-Liganden induziert jedem Bund Änderungen PeroxiBAS Inneren Peroxisomen 8. Wie die Natur dieser Diskrepanz nicht bekannt ist, das Protokoll unten auf CytoBAS und NucleoBAS konzentriert.
Die Verwendung dieser genetisch kodierte FRET Sensor wurde kürzlich in den Zellen der Leber-Gallensäure-Transporter Na + / Taurocholat co-transportierenden Polypeptids (NTCP) und gelöstem organischen Stoff transporter alpha / beta (OSTαβ) 8, enthaltend gezeigt. NTCP ist der Hauptlebergallensäure Importeur und OSTαβ ist eine basolaterale Darm-Galle-Transporter, die sowohl als Importeur und Exporteur von der elektrochemischen Gallensäure Konzentrationsgradienten 9, 10 funktionieren kann. Neuere Daten zeigen, dass bei der Gallensäure-Transport durch NTCP und / oder OSTαβ, robusten und schnellen Reaktionen in FRET-Verhältnis infolge der Ligand-FXR-LBD Wechselwirkung beobachtet werden.
Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für Methoden zur FRET zu messen, wie die konfokale mikroskopische Analyse und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), markieren wichtige Schritte, potenzielle Probleme anzugehen und alternative Methoden zu diskutieren. Mit dieser genetisch kodierte FRET-Sensor, können Gallensäure Interaktion mit FXR-LBD quantifiziert und direkt in lebenden Zellen überwacht werden und bietet eine schnelle und einfache Methode zur Visualisierung Gallensäuretransport und Dynamik in Echtzeit. Säuger-Expressionsplasmiden CytoBAS und NucleoBAS kodieren, sind im Handel erhältlich. Daher kann diese Biosensor weiter auf die beitragenVerständnis der Gallensäure-Transporter oder Verbindungen, die FXR aktivieren und einen tieferen Einblick in Gallensäure Biologie und Signalisierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines neuen genetisch codierten Gallensäuresensor zur Überwachung des raumzeitlichen Dynamik der Gallensäure-Transport in lebenden Zellen. Dieser Biosensor besteht aus cerulean und Citrin fluoreszierende Proteine, die FXR-LBD verschmolzen werden, wodurch ein FRET-Gallensäuresensor (BAS) bilden.
Die Gallensäure-Sensor ist relativ einfach und bequem im Einsatz, wenn mit grundlegenden Erfahrungen mit Zellkultur und FACS oder …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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