एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट आधारित पित्त अम्ल सेंसर का उपयोग Intracellular पित्त अम्ल गतिशीलता की वास्तविक समय की निगरानी
Summary
We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.
Introduction
Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) व्यापक रूप से उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प 1 के साथ जीवित कोशिकाओं में सेलुलर कार्यों की बेहतर समझ हासिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। झल्लाहट में, एक उत्साहित दाता fluorophore से ऊर्जा एक स्वीकर्ता fluorophore को सौंप दिया है। झल्लाहट दक्षता दाता और स्वीकर्ता fluorophore और उनके अभिविन्यास के बीच की दूरी पर निर्भर है और इसलिए दो fluorophores को प्रभावित करने वाले गठनात्मक परिवर्तन का एक संवेदनशील readout है। इस घटना छोटे अणुओं की इमेजिंग के लिए झल्लाहट आधारित biosensors उत्पन्न करने के लिए शोषण किया जाता है। बढ़ जाती है / दाता fluorophore 2 बनाम स्वीकर्ता की उत्सर्जन तीव्रता के अनुपात में कम हो जाती है के रूप में उनकी एकाग्रता में परिवर्तन पर नजर रखी जा सकती है। उदाहरण के लिए, झल्लाहट आधारित कैल्शियम biosensors 3 कोशिकाओं में रहने वाले मुक्त कैल्शियम की सांद्रता के तेज और स्थिर पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। झल्लाहट आधारित biosensors के अन्य लाभ भी जीवित कोशिकाओं में इमेजिंग, टीवारिस गैर invasiveness, उनकी क्षमता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और सेलुलर डिब्बों 4 को लक्षित किया जाना है।
इंट्रासेल्युलर पित्त अम्ल गतिशीलता के कई पहलुओं को अभी भी खराब समझ रहे हैं। उदाहरण के लिए, थोड़ा संयुग्मित और विसंयुग्मित पित्त अम्ल परिवहन की व्यवस्था के अंतर्निहित नियमन के बारे में जाना जाता है। तकनीक मौजूदा इस परिवहन मुख्यतः luciferase आधारित पत्रकारों, radiolabeled पित्त अम्ल, या फ्लोरोसेंट पित्त अम्ल एनालॉगों का इस्तेमाल करते नजर रखने के लिए। उत्तरार्द्ध संभवतः उनके गुणों को प्रभावित पित्त अम्ल के संशोधन की आवश्यकता है। Luciferase आधारित संवाददाताओं से गरीब समय संकल्प है। इसके अलावा, इन तकनीकों का नमूना के नुकसान में परिणाम और एकल कक्षों में इमेजिंग के लिए लागू नहीं कर रहे हैं। इसलिए, यह यह ratiometric का पता लगाने के 5, 6 का लाभ शामिल है, खासकर जब से झल्लाहट biosensors का उपयोग करते हुए परिवहन गतिविधि का जीना एकल कोशिका इमेजिंग की अनुमति है कि तरीकों का उपयोग करने के लिए फायदेमंद होगा। जबकि सीएफ के वेरिएंटपी / YFP फार्म का सबसे अक्सर झल्लाहट जोड़े, एक लाल स्थानांतरित पित्त अम्ल सेंसर 7 सहित उपन्यास सेंसर के साथ झल्लाहट उपकरण बॉक्स का एक विस्तार करने के लिए नेतृत्व किया है स्वयं संघ उत्प्रेरण म्यूटेशन ले जाने Morange और mCherry का उपयोग करते हुए नई रणनीति का इस्तेमाल किया।
हम पहले farnesoid एक्स रिसेप्टर (FXR) ligand बाध्यकारी डोमेन के साथ जुड़े हुए हैं कि एक दाता fluorophore (आसमानी) और एक स्वीकर्ता fluorophore (सिट्रीन) के होते हैं कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट पित्त अम्ल सेंसर (बास), निर्माण (FXR-LBD) और एक पेप्टाइड एक LXXLL मूल भाव 8 युक्त। एक पित्त अम्ल निर्भर तरीके में FXR-LBD साथ इस पेप्टाइड एसोसिएट्स। FXR सक्रियण पर, सिट्रीन और आसमानी के बीच की दूरी एक गठनात्मक परिवर्तन के कारण बदल जाएगा। स्तनधारी सेल लाइनों में, सिट्रीन / आसमानी अनुपात में एक स्पष्ट रूप से पहचाने जाने वृद्धि में FXR सक्रियण परिणाम, शुद्ध सेंसर विपरीत दिशा में काम करता है और FXR सक्रियण पर एक कम झल्लाहट अनुपात की ओर जाता है। यह सेंसर (CytoBAS)साइटोसोलिक पित्त अम्ल गतिशीलता की निगरानी की अनुमति देता है। Subcellular को निशाना रूपांकनों के carboxyl टर्मिनल अलावा करके, बास का निर्माण विभिन्न सेलुलर डिब्बों में पित्त अम्ल की सांद्रता की माप की अनुमति, नाभिक (NucleoBAS) और peroxisomes (PeroxiBAS) को निशाना बनाया जा सकता है। Peroxisomal लक्ष्य-निर्धारण मूल भाव के अलावा पित्त अम्लों को अपनी जवाबदेही ख़राब नहीं करता है, सेल पारगम्य FXR-ligands के किसी भी peroxisomes 8 अंदर PeroxiBAS के परिवर्तन झल्लाहट के लिए प्रेरित नहीं किया। इस विसंगति की प्रकृति अज्ञात है, प्रोटोकॉल नीचे CytoBAS और NucleoBAS पर ध्यान केंद्रित किया है।
इस आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट सेंसर का उपयोग हाल ही में यकृत पित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों / + taurocholate सह परिवहन पॉलीपेप्टाइड (NTCP) ना और जैविक घुला हुआ ट्रांसपोर्टर अल्फा / बीटा (OSTαβ) 8 युक्त कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया। NTCP प्रिंसिपल यकृत पित्त अम्ल आयातक है और OSTαβ एक basolateral आंतों पित्त हैविद्युत पित्त अम्ल एकाग्रता ढाल 9, 10 पर निर्भर है एक आयातक और निर्यातक के रूप में दोनों कार्य कर सकते हैं कि एसिड ट्रांसपोर्टर। हाल के आंकड़ों से NTCP और / या OSTαβ द्वारा पित्त अम्ल परिवहन पर, ligand-FXR-LBD बातचीत का एक परिणाम के रूप में झल्लाहट अनुपात में मजबूत और तेजी से प्रतिक्रिया मनाया जा सकता है कि पता चला है।
यहाँ, हम इस तरह के कोंफोकल सूक्ष्म विश्लेषण और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के रूप में झल्लाहट को मापने के लिए तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन महत्वपूर्ण कदम पर प्रकाश डाला, संभावित समस्याओं को संबोधित करने और वैकल्पिक तरीकों पर चर्चा की। इस आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट सेंसर का उपयोग करना, FXR-LBD साथ पित्त अम्ल बातचीत मात्रा निर्धारित और जीवित कोशिकाओं में सीधे नजर रखी और वास्तविक समय में पित्त अम्ल परिवहन और गतिशीलता visualizing की एक तेजी से और सरल तरीका प्रदान करता जा सकता है। CytoBAS और NucleoBAS एन्कोडिंग स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लास्मिडों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इसलिए, इस biosensor आगे करने के लिए योगदान कर सकते हैंपित्त अम्ल ट्रांसपोर्टरों या FXR को सक्रिय करने और पित्त अम्ल जीव विज्ञान और संकेतन में एक गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं कि यौगिकों की समझ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम जीवित कोशिकाओं में पित्त अम्ल परिवहन के spatiotemporal गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम एक उपन्यास आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पित्त अम्ल सेंसर के इस्तेमाल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस biose…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).
Materials
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) – Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg / ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6×8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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