Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
Con el fin de estudiar las vías moleculares de la enfermedad de Parkinson (PD) y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, investigadores científicos se basan en modelos animales. La identificación de genes asociada a la DP ha llevado al desarrollo de modelos de PD genéticos. modelos de ratón α-SYN la mayoría transgénicos desarrollan la patología progresiva α-SYN, pero no se muestran pérdida de células dopaminérgicas clara y déficits de comportamiento de dopamina dependiente. Este obstáculo fue superado por la orientación directa de la sustancia negra con vectores virales que sobreexpresan genes asociada a la DP. la entrega de genes usando vectores virales local ofrece una forma atractiva para expresar transgenes en el sistema nervioso central. Regiones específicas del cerebro pueden ser dirigidos (por ejemplo, la sustancia negra), la expresión puede ser inducida en la configuración de adultos y los niveles de expresión altos se puede lograr. Además, diferentes sistemas de vectores basados en diferentes virus pueden ser utilizados. El protocolo describe todos los pasos cruciales para llevar a cabo un vector viralinyección en la sustancia negra de la rata para desarrollar un modelo animal alfa-sinucleína basadas en vector viral para la enfermedad de Parkinson.
Introduction
Para el estudio de la fisiopatología de la EP y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, existe una necesidad urgente de modelos animales que se parecen mucho a los síntomas de neuropatología, fisiología y motores de la EP humano. Cuanto mayor sea el valor predictivo, mejor que se puede traducir nuevas terapias de modelos animales para los pacientes.
El descubrimiento de la alfa-sinucleína (α-SYN) como el primer gen PARQUE en 1997 condujo al desarrollo de los primeros modelos de PD genéticos. Muchos ratones transgénicos que sobreexpresan humanos de tipo salvaje (WT) o mutante (A30P, A53T) α-SYN se han generado en la última década. Los niveles de sobreexpresión de α-SYN han demostrado ser crucial en el desarrollo de la patología. También la cepa de ratón, la presencia o ausencia de endógeno α-SYN y si la longitud completa o una forma truncada se expresa, juega un papel (revisión detallada por Magen y Chesselet 1). La sobreexpresión tanto de WT y varios mutantes clínicos de humano y# 945; -SYN en ratones transgénicos induce la acumulación patológica de α-SYN y la disfunción neuronal 2-6. Sin embargo, hasta modelos de ratón α-SYN ahora más transgénicos no lograron mostrar la pérdida de células dopaminérgicas clara y déficits de comportamiento de dopamina dependiente.
Este obstáculo fue superado por la orientación directa de la sustancia negra (SN) con vectores virales que sobreexpresan α-SYN. Los vectores virales se derivan de virus que pueden infectar fácilmente células, introducir material genético en su genoma del huésped y la fuerza de la célula huésped para replicar el genoma vírico con el fin de producir nuevas partículas de virus. Los virus pueden ser diseñados para vectores no replicantes virales que retienen su capacidad para entrar en las células e introducir genes. Al eliminar partes del genoma viral y su sustitución por los genes de interés, la aplicación del vector se traducirá en una sola infección ronda sin replicación en la célula huésped, designado en general como "transducción". Los vectores virales cun ser utilizado tanto para la sobreexpresión y silenciamiento de genes. El transgén puede ser expresado una proteína indicadora (por ejemplo, proteína verde fluorescente o luciferasa de luciérnaga) 7, una proteína terapéutica para aplicaciones de terapia génica 8-10 o, como nos centraremos en en este documento, una proteína relacionada con la enfermedad utilizada para modelar la enfermedad 11 -14.
la entrega de genes mediada por vectores virales proporciona una forma alternativa de expresar transgenes en el SNC con varias ventajas. El uso de la entrega transgén locales, regiones específicas del cerebro pueden ser dirigidos. Además, la expresión del transgen puede ser inducida durante la edad adulta disminuyendo el riesgo de mecanismos de compensación durante el desarrollo. Además, los modelos se pueden crear en diferentes especies y cepas. Y, por último, los distintos transgénicos pueden combinarse con facilidad. El uso de vectores virales, los niveles de expresión de transgenes alta se puede lograr, lo que podría ser crucial ya que el inicio de la enfermedad y la gravedad con frecuencia dependen del nivel de Sobreexpresión.
Varios sistemas de vectores basados en diferentes virus se han desarrollado. La elección del sistema de vector depende del tamaño del gen de interés, la duración requerida de la expresión génica, la célula diana y la seguridad biológica. Para la transferencia génica estable en el cerebro, lentiviral (LV) y viral adeno-asociado recombinante (rAAV) vectores ahora se consideran los sistemas de vectores de elección ya que conducen a la expresión génica eficaz y a largo plazo en el cerebro de roedores. Para la orientación específica de las neuronas dopaminérgicas (DN) de la SN, vectores rAAV han outcompeted gradualmente vectores LV debido a sus mayores títulos y la eficacia de transducción de DN.
Los mejores modelos de roedores basado α-SYN disponibles en la actualidad se han desarrollado a partir de un enfoque combinado usando nuevos serotipos de AAV (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) y construcciones de vectores, los títulos, y pureza 15,16 optimizado. El título de vector, así como la pureza vector influye directamenteel resultado fenotípico del modelo. títulos de vector excesivas o lotes vector insuficientemente purificadas pueden dar lugar a toxicidad no específica. Por lo tanto, los vectores de control adecuados son indispensables. la inversión un tiempo considerable en la producción de vectores, ampliación de la escala, y los procedimientos de purificación viral también han demostrado ser esenciales para obtener lotes de vectores reproducibles y de alta calidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos dentro del protocolo. El título de vector, así como la pureza vector influye directamente en el resultado fenotípico del modelo. títulos de vector excesivas o lotes vector insuficientemente purificadas pueden dar lugar a toxicidad no específica. Por lo tanto, el uso de lotes de vectores de alta calidad y vectores de control apropiadas es indispensable. Además, la colocación exacta de la cabeza de la rata en el marco estereotáxico y la determinación precisa de las coordenadas es esenci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Joris van Asselberghs y Ann Van Santvoort por su excelente asistencia técnica. La investigación fue financiada por el IWT-Vlaanderen (TVN SBO / 80020), la FWO Vlaanderen (G.0768.10), por el programa CE-6PM 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), el proyecto MEFOPA 7PM de IDT (SALUD -2009-241791), el programa FP7 'inMind' (SALUD-F2-2011-278850), la Universidad Católica de Lovaina (IOF-PK / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), y el Fundación MJFox (validación de dianas 2010). A. Van der Perren y C. Casteels son un postdoctorantes del Fondo Flamenco de Investigaciones Científicas. K. Van Laere es miembro clínico de alto rango del Fondo Flamenco de Investigaciones Científicas.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
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