Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.
The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.
Hovdyrets herpesvirus-2 (EHV-2) er involveret i en respiratorisk syndrom, med potentielle kliniske manifestationer såsom næseflåd, pharyngitis og hævede lymfeknuder 1-3. Denne virus er også mistænkt for at være forbundet med den ringe ydeevne af heste, hvilket kan resultere i en betydelig og negativ økonomisk virkning for hesten industrien 2.
Indtil nu, den gyldne standard for gamma-EHV (γ-EHV) detektion var cellekulturen metoden. Den første ulempe af denne procedure var der ikke foreligger forskelsbehandling mellem EHV-2 og andre γ-EHV s (f.eks EHV-5). Den anden ulempe var den langsomme udvikling af cytopatisk proces, som tager fra 12 til 28 dage at manifestere 4,5.
Udvikling af en valideret og normaliseret kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR) -metoden vil bidrage til hurtigt påvise virus, for at skelne mellem EHV-2 og EHV-5 og at undersøge forholdet mellem det virale genom belastningen og sygdommen takket være kvantificering aspekt.
Polymerasekædereaktion (PCR) blev beskrevet for første gang i 1986 af Mullis 6 og er ved at blive den nye guld standard i de fleste af felterne af biologisk diagnose (human, miljø og veterinær). Denne metode, som er baseret på amplifikation af en del af genomet af patogener, som indebærer mange fordele: specificitet, følsomhed og hurtighed. Endvidere er risikoen for amplicon kontaminering aftaget siden indførelsen af QRT-PCR og kvalitetssikring 7. Ikke desto mindre er anerkendelsen af PCR som en ny guldstandard metode nødvendiggjorde mere end blot forbedret ydeevne data, men også demonstration af styring af udvikling og validering trin i hele metode uden forringelse af ydeevnen over tid.
De første molekylære værktøjer, der anvendes til påvisning af EHV-2 var tid consuming og involverede ikke-specifik amplifikation med nestede PCR efterfulgt af sekventering 8. De målrettede gener for herpes-vira var deoxyribonukleinsyre (DNA) polymerase og DNA emballage 9. Men nested PCR præsenterer, en høj risiko for forurening med amplikoner. Siden da har konventionelle PCR-test er designet til at forstærke interleukin 10-lignende gen eller glycoprotein B genet, revideret i 2009 2. For nylig blev real-time PCR egenskaber beskrevet til kvantificering af EHV-2 10, men ingen data var tilgængelige om validering af hele metoden herunder udtræk proces.
I denne protokol, er udviklings- og valideringsprocedurer beskrevet for en kvantitativ PCR-metode til påvisning og kvantificering af EHV-2 DNA i heste respiratoriske væsker ifølge Sammenslutningen française de normalisering (AFNOR) norm NF U47-600 3,11,12, som er den franske repræsentant iden internationale normalisering udvalget. Denne norm beskriver "Krav og anbefalinger til gennemførelse, udvikling og validering af veterinære PCR i dyresundhed analysemetode" 11,12, i henhold til NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 og OIE (Verdensorganisationen for Dyresundhed) . anbefalinger, 2010 14 EHV-2 QRT-PCR valideringsprotokollen indebærer en tredelt fremgangsmåde: (a) udvikling af QRT-PCR assay, (b) karakterisering af QRT-PCR assay alene og (c) karakterisering af det hele analysemetode (fra ekstraktion af nukleinsyrer fra den biologiske prøve til PCR-analyse).
Karakteriseringen af QRT-PCR assay og af hele analysemetoden omfatter definitionen af to grænser: detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ). LOD 95% PCR repræsenterer det laveste antal nukleinsyre kopier pr volumen, der kan påvises i 95% af alle cases. Den LOQ 95% PCR repræsenterer den laveste mængde af nukleinsyre kopier, der kan bestemmes under hensyntagen til de usikkerheder.
Dette QRT-PCR-fremgangsmåden muliggør nøjagtig detektering og hurtig kvantificering af EHV-2 i respiratoriske væsker. Desuden kunne fremgangsmåden anvendes i andre laboratorier for at sikre en standardiseret procedure og som generel skabelon for udvikling af andre nye QRT-PCR-assays.
Siden 2000'erne har real-time PCR afløst guld standard teknikker (cellekultur og bakterier dyrkningsmetoder) i et stigende antal laboratorier. Gennemførelse af teknikken er forholdsvis let. Men validering af laboratoriemetoder er afgørende for molekylær påvisning og kvantificering af patogener for at sikre nøjagtige, reproducerbare og pålidelige data.
Da ekstraktionstrinnet er den primære kilde til tab af biologisk materiale, kan det betragtes som den vigtigste kilde til fejl for kvantificering mellem en protokol og en anden. Som sådan, oprettelse af en standardkurve for DNA-plasmid under QRT-PCR, hovedsagelig rapporteret i litteraturen, angiver det virale genom belastning, men tager ikke højde for ekstraktionstrinet.
Beskrivelse af en de novo strategi for en hel metodevalidering proces i AFNOR norm NF U47-600-2 udgør et betydeligt fremskridt på dette område. Som illustreret idette papir til EHV-2 hos heste, eller ved andre i bier 21, dette kræver klar differentiering mellem udviklingen trin og valideringen trin med karakterisering af PCR og karakterisering af hele fremgangsmåden. En begrænsning i denne interessante tilgang er, at enhver ændring i protokollen, vil resultere i en forpligtelse til at forny den komplette proces, der kan være meget dyrt. Denne begrænsning blev også understreget af det faktum, at for grænserne af kvantificering afhænger af kilden, hvorfra virusset ekstraheres (fx respiratoriske væsker, organer, blod eller urin). Faktisk hver matrice viser forskellige specificiteter i deres fysisk-kemiske egenskaber, og det er vigtigt at definere uafhængigt hver forskellig anvendte matrix for viral påvisning og kvantificering af QRT-PCR. Således kan det virale genom belastning af hver biologisk prøve kvantificeres mere præcist fra udvinding. Karakteriseringen tager også hensyn til thermocycler model og når brugen af en tidligere velkarakteriseret metode (f.eks EHV-2 qPCR metoden beskrevet i dette papir) nødvendiggør en ny type maskine i moderselskabet laboratorium eller andet laboratorium, må man bekræfte effektiviteten af dette instrument. Bekræftelsen af udførelsen af en qPCR-analysen er en forudsætning for alle tests sætter et laboratorium. Dette opnås normalt ved at analysere en reference prøve med kendte egenskaber. En sådan kontrol er en forudsætning og betragtes som obligatoriske som krævet af NF 47-600-1 AFNOR norm for at validere resultaterne af qPCR (LOD, LOQ effektivitet) og robustheden af hele metoden (LOD, LOQ). Ikke kun i udviklings- og karakterisering trin, men også når de anvendes i forskning eller til diagnostiske formål, kan de risikofaktorer identificeres og godt kontrolleres for at sikre standardisering af protokollen. Af særlig interesse er tilstrækkelig uddannelse af personale, højt kvalificeret personale, kvalitetskontrol af forbrugsstofferanvendes og deres opbevaring, styring af de umiddelbare miljøforhold og bevidsthed om måletekniske forhold, der kan påvirke ydeevnen af de videnskabelige instrumenter, der er involveret i analysen. Anvendelse af referenceprøver for sammenligninger mellem forskellige laboratorier kan også hjælpe med at kontrollere usikkerheden. På denne måde kan sammenligning af data mellem laboratorier lettes. Faktisk mellem laboratorier præstationsprøvninger er afgørende for at vurdere og bekræfte metodens reproducerbarhed.
Virale genom belastning resultater, der er udtrykt i internationale enheder (IE) af den analyserede biologiske matrix (IU: kopier / ml for væsker eller kopier / g for væv) er lettere at bruge for at sammenligne resultater mellem forskellige laboratorier. Alle resultater over LOQ er udtrykt som kopier / ml og et resultat mellem LOD og LOQ er taget som et ikke kvantificerbare positivt resultat. Præsentere quantificational data af genomet på denne måde i overensstemmelse mere præcist til process analyser (opformering af genom). Faktisk i celledyrkningsforsøg, ekspression af virale belastning ved TCID50 (median vævskultur infektiøs dosis) er afhængig af naturen af cellerne og virusstammer. Hver stamme linje besidder sine unikke infektion kinetik og nogle vira som EHV-2 kan tage flere dage, før den første cytopatogen effekt er tydelig.
Afslutningsvis bør denne nye metode til karakterisering af QRT-PCR lette harmoniseringen af data præsentation og fortolkning mellem laboratorier. Dette vil være meget nyttigt for eventuelle nye anvendelser af QRT-PCR i fremtiden som oprettelsen af en cut-off værdi for angivelse af status sygdom i stedet for blot tilstedeværelsen eller fraværet af patogenet.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate | Dutsher | 16924 | |
Adhesive film QPCR Absolute | Dutsher | 16629 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
0.5 mL microtubes, skirted, caps | Dutsher | 039258 | |
Ethanol 98% | Sodipro | SAF322941000 | |
Primers | Eurofins | Custom order | |
Probe | Life Technologies | Custom order | |
Plasmid | Eurofins | Custom order | |
QIAamp RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL buffer, AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) |
Qiagen | 52906 | AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C |
Sequencing by Sanger method | Eurofins | Custom order | |
Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4364340 | |
Tris-EDTA buffer solution | Santa Cruz | sc-296653A | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-2000C | |
StepOnePlus Real-Time PCR systems | Life Technologies | 4376600 | pre-warm 15 min |