Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.
The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.
Equid herpesvirus-2 (EHV-2) er involvert i en luftveissyndrom, med potensielle kliniske manifestasjoner som rennende nese, faryngitt og hovne lymfeknuter 1-3. Dette viruset er også mistenkt for å være assosiert med den dårlige ytelse av hester, noe som kan resultere i en betydelig og negative økonomiske konsekvenser for hesteindustrien 2.
Inntil nå, gullstandarden for gamma-EHV (γ-EHV) deteksjon var celledyrkningsmetode. Den første ulempe med denne fremgangsmåten var fraværet av diskriminering mellom EHV-2 og andre γ-EHV-tallet (f.eks EHV-5). Den andre ulempe var den langsomme utvikling av cytopatiske prosess, som tar fra 12 til 28 dager for å manifestere 4,5.
Utvikling av en validert og normalisert kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) metoden vil hjelpe til å raskt påvise virus, for å diskriminere mellom EHV-2 og EHV-5 og for å studere sammenhengen mellom det virale genomet belastning og sykdoms takket være kvantifisering aspekt.
Polymerase kjedereaksjon (PCR) ble beskrevet for første gang i 1986 av Mullis 6 og er i ferd med å bli den nye standarden i de fleste av de felt av biologisk diagnose (human, miljø og veterinær). Denne metoden, som er basert på amplifikasjon av en del av genomet av patogener, gir mange fordeler: spesifisitet, følsomhet og hurtighet. Videre risikoen for amplicon forurensning trukket seg tilbake siden advent av QRT-PCR og kvalitetssikring 7. Likevel anerkjennelse av PCR som en ny gullstandard metode nødvendig mer enn bare forbedret ytelse data, men også demonstrasjon av kontroll av utviklings- og validerings trinn av hele metoden uten degradering av ytelse over tid.
De første molekylære verktøy som brukes for deteksjon av EHV-2 var tid consuming og involvert uspesifikk amplifikasjon med nestet PCR etterfulgt av sekvense 8. De målrettede gener for herpesvirus ble deoksyribonukleinsyre (DNA)-polymerase og DNA-pakking 9. Imidlertid presenterer nestet PCR en høy risiko for forurensning av amplikonene. Siden da har konvensjonelle PCR tester er designet for å forsterke interleukin 10-lignende gen eller glykoprotein B-genet, anmeldt i 2009 2. Mer nylig, real-time PCR-egenskaper ble beskrevet for kvantifisering av EHV-2 10, men ingen data var tilgjengelige om validering av hele fremgangsmåten inkluderer ekstraksjonsprosessen.
I denne protokollen, utviklings- og valideringsprosedyrer beskrevet for en kvantitativ PCR-metode for påvisning og kvantifisering av EHV-2 DNA i equine luftveis væsker i henhold til Association Française de normalisering (AFNOR) normen NF U47-600 3,11,12, som er den franske representanten iden internasjonale normalisering komiteen. Denne normen detaljer "Krav og anbefalinger for gjennomføring, utvikling og validering av veterinær PCR i dyrehelse analysemetode" 11,12, i henhold til NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 og OIE (Verdens dyrehelseorganisasjon) . anbefalinger, 2010 14 EHV-2 QRT-PCR valideringsprotokoll omfatter en tredelt prosedyre: (a) utvikling av QRT-PCR-analyse, (b) karakterisering av QRT-PCR-analyse alene og (c) å karakterisere hele analytisk metode (fra ekstrahering av nukleinsyrer fra den biologiske prøven for å PCR-analyse).
Karakterisering av QRT-PCR-analyse og av hele analysemetoden omfatter definisjonen av to grenser: deteksjonsgrense (LOD) og kvantifiseringsgrensen (LOQ). LOD 95% PCR representerer det laveste antallet nukleinsyre eksemplarer per volumenhet som kan oppdages i 95% av alle cases. LOQ 95% PCR representerer den laveste mengden av nukleinsyre-kopier som kan bestemmes idet det tas hensyn til usikkerhet.
Dette QRT-PCR metoden gjør nøyaktig deteksjon og hurtig kvantifisering av EHV-2 i luftveis væsker. Videre kan fremgangsmåten anvendes i andre laboratorier for å sikre en standardisert fremgangsmåte, og som generelt templat for utvikling av andre nye QRT-PCR-analyser.
Siden 2000-tallet, har real-time PCR vært å erstatte gullstandardteknikker (cellekultur og bakterier kultur metoder) i et økende antall laboratorier. Gjennomføring av den teknikk som er forholdsvis enkelt. Men validering av laboratoriemetoder er viktig for molekylær deteksjon og kvantifisering av patogener for å sikre nøyaktige, repeterbare og pålitelige data.
Etter ekstraksjonstrinnet er den primære kilde til tap av biologisk materiale, kan det betraktes som hovedkilden til feil for mengde mellom en protokoll og en annen. Som slike, etablering av en standardkurve av DNA-plasmid under QRT-PCR, hovedsakelig rapportert i litteraturen, viser det virale genomet belastning, men tar ikke hensyn til ekstraksjonstrinnet.
Beskrivelse av en de novo strategi for en hel fremgangsmåte valideringsprosessen i AFNOR norm NF U47-600-2 representerer et betydelig fremskritt på dette området. Som illustrert iDette papir for EHV-2 hos hester, eller ved andre i bier 21, nødvendiggjør dette klart skille mellom fremkallingstrinnet og valideringstrinnet med karakterisering av PCR og karakterisering av hele fremgangsmåten. En begrensning i dette interessant tilnærming er at enhver endring i protokollen vil resultere i plikten til å forlenge hele prosessen som kan være svært kostbart. Denne begrensningen er også understreket ved det faktum at rammen av kvantifisering avhengig av kilden som den virus ekstraheres (f.eks, respiratoriske væske, organer, blod eller urin). Faktisk, presenterer hver matrise forskjellige spesifisiteter i sine fysisk-kjemi egenskaper, og det er viktig å definere uavhengig ved hver forskjellig matrise brukes for viral deteksjon og kvantifisering av QRT-PCR. Således kan det virale genomet belastningen av hver biologisk prøve kvantifiseres mer presist fra ekstraksjonen. Karakterisering tar også hensyn til termo model og ved bruk av en tidligere godt karakterisert metode (f.eks EHV-2 qPCR metode som er beskrevet i denne artikkelen) nødvendiggjør en ny type maskin i moder laboratorium eller et annet laboratorium, må man bekrefte ytelsen til det instrument. Bekreftelsen av ytelsen til en qPCR-analyse er en forutsetning for alle tester bringe inn i et laboratorium. Dette oppnås normalt ved å analysere en referanseprøve med kjente egenskaper. En slik sjekk er en forutsetning og anses obligatorisk som anmodet av NF 47-600-1 AFNOR norm for å validere resultatene av qPCR (LOD, LOQ effektivitet) og robustheten i hele metoden (LOD, LOQ). Ikke bare under utvikling og karakterisering trinn, men også når det brukes i forskning eller for diagnostiske formål, kan risikofaktorer identifiseres og godt kontrollert for å sikre standardisering av protokollen. Av spesiell bekymring er tilstrekkelig opplæring av personalet, høyt kvalifisert personell, kvalitetskontroll av forbruksvarerbrukt og deres lagring, kontroll av de umiddelbare miljøforhold og bevissthet om metrologiske forhold som kan påvirke resultatene av vitenskapelige instrumenter som er involvert i analysen. Bruk av referanseprøver for inter-laboratorium sammenligninger kan også bidra til å kontrollere usikkerhet. På denne måte kan sammenligning av data mellom laboratorier lettes. Faktisk, inter-laboratorietegnethetsprøvinger er nødvendig for å evaluere og bekrefter reproduserbarheten av fremgangsmåten.
Viral genom last resultater som uttrykkes i internasjonale enheter (IE) analysert biologisk matrise (IE: kopier / ml for væsker eller kopier / g for vev) er lettere å bruke for å sammenligne resultater mellom ulike laboratorier. Alle resultatene ovenfor LOQ er uttrykt som kopier / ml og et resultat mellom LOD og LOQ er tatt som et ikke-kvantifiserbare positivt resultat. Presentere quantificational data fra genomet på denne måte i overensstemmelse mer presist å forarbeides analyser (amplifikasjon av genomet). Faktisk, i cellekultur eksperimenter, ekspresjon av virusmengde ved TCID 50 (median vevskultur infeksiøs dose) er avhengig av typen av celler og virusstammer. Hver stamme linjen besitter sine unike infeksjon kinetikk og noen virus som EHV-2 kan ta flere dager før den første cytopatogen effekten er åpenbar.
I konklusjonen, bør denne nye metoden for karakterisering av QRT-PCR lette harmonisering av data presentasjon og tolkning mellom laboratorier. Dette vil være svært nyttig for eventuelle nye anvendelser av QRT-PCR i fremtiden som etablering av en cut-off verdi for deklarasjon av sykdomsstatus i stedet for bare nærvær eller fravær av organismen.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Sophie Castagnet and Nadia Doubli-Bounoua for their technical support. This work received financial support from the General Council of Calvados and the agreement of Region Basse-Normandie and French Government (CPER 2007-2013; project R25 p3). The authors would like to thank the experts of the AFNOR group and particularly Jean-Philippe Buffereau and Eric Dubois.
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate | Dutsher | 16924 | |
Adhesive film QPCR Absolute | Dutsher | 16629 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
0.5 mL microtubes, skirted, caps | Dutsher | 039258 | |
Ethanol 98% | Sodipro | SAF322941000 | |
Primers | Eurofins | Custom order | |
Probe | Life Technologies | Custom order | |
Plasmid | Eurofins | Custom order | |
QIAamp RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL buffer, AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) |
Qiagen | 52906 | AVL buffer: pre-warm 5 min at 72°C |
Sequencing by Sanger method | Eurofins | Custom order | |
Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4364340 | |
Tris-EDTA buffer solution | Santa Cruz | sc-296653A | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-2000C | |
StepOnePlus Real-Time PCR systems | Life Technologies | 4376600 | pre-warm 15 min |