Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
Zellen innerhalb der CPF gewachsen sehen keine Veränderungen in Sauerstoff oder Kohlendioxid-Konzentrationen, wie sie von Inkubator bewegen Kammer zu Behandlungskammer zu Mikroskop und zurück. Es ist wichtig, dass die Bedingungen in jeder Kammer an den jeweiligen Inkubator abgestimmt sind, in dem die Zellen gehalten werden, bevor die Zellen aus dem Inkubator entfernt werden. Die Atmosphäre innerhalb der Vorrichtung kontinuierlich HEPA-gefilterten und ist anpassbar in bezug auf Sauerstoff und Kohlendioxid-Konzentrationen. Zellen können in Standardkonzentrationen für PSCs oder NSC, 5% und 9%, jeweils aufgewachsen werden; oder alternative Konzentrationen können für verschiedene Zelltypen oder für bestimmte Experimente ausgewählt werden. Somit ist die Vorrichtung mit konstantem Quellen medizinischer Qualität Sauerstoff, Kohlendioxid und Stickstoff (Figur 4) zugeführt wird . Alle drei dieser Gase werden durch gasspezifische Verteilersysteme geliefert, die die konstante Versorgung gewährleisten. Die Vorrichtung ist außerdem mit einem Kalibriergas zugeführt Mischung, bestehend aus10% (± 0,01%) Kohlendioxid in Sauerstoff. Die Verteilersysteme sind außerhalb der Zelle Produktionsanlage untergebracht ist und die Gase in die Anlage durch die Decke geleitet. Das Kalibrierungsgas wird innerhalb der Anlage untergebracht. Das Gerät ist zusätzlich mit Hausvakuum, auch durch die Decke geliefert. Mit einem elektronischen Überwachungssystem und drahtlose Sendeeinheiten werden die Ausgangsdrücke aller Sammelleitungen ständig überwacht. Im Falle, dass jeder Druck außerhalb des Bereichs fällt, werden die Zellproduktionsanlagenbetreiber automatisch angerufen und mitgeteilt, so dass entsprechende Maßnahmen ergriffen werden können.
Der Energiebedarf der Vorrichtung werden durch sechs dedizierte 120 V-Stromkreise erfüllt die von der Decke herabfahren und des Krankenhauses Back-up-Generatoren verbunden, um eine konstante Versorgung zu gewährleisten. Der Betrieb der Vorrichtung wird über die Software auf einem PC-basierten Computer über eine unterbrechungsfreie Stromversorgung mit Strom versorgt gesteuert. Diese Macht und Computeranordnungensicherzustellen, dass die Systemfunktionen kontinuierlich auch im Falle eines öffentlichen Netzsystemausfall. Die Software die Steuervorrichtung hat eine benutzerfreundliche graphische Schnittstelle (Abbildung 1) , die ebenso wie Temperatur, Feuchtigkeit, und die Kammer ermöglicht Drücke für die Kontrolle von Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen. Die Werte aller dieser Parameter werden kontinuierlich eine laufende Aufzeichnung aller Geräteparameter zur Verfügung zu stellen aufgezeichnet. Diese Daten werden jede Nacht auf einem Remote-Server gesichert, um ihre Integrität zu schützen. Der Computer und die Software kann von Administratoren Remote-Zugriff zu bewerten und / oder jeden Parameter ändern. Darüber hinaus kann der Computer und Software aus der Ferne zugegriffen werden kann, interaktive Beurteilung von Geräteparametern ermöglicht und mit lokalen Benutzern zur Fehlerbehebung. Eine zusätzliche Alarm-Sendeeinheit ist mit dem Gerät verbunden, so dass die Zellproduktion Anlagenbetreiber jeglicher Out-of-Range-Zustand des Gerätes informiert werden. Der RAS-capabilities lassen sich einloggen und Beurteilung der Besonderheiten des Out-of-Range-Zustand.
Die Vorrichtung ist als modulares System entwickelt, um sowohl in einer Makro- und einer Mikro Sinn. Einzelnen Zellkulturmodule wie Inkubatoren und Behandlungskammern können in Bezug auf ihre Abmessungen und Anforderungen sowie in deren Anordnung in Bezug zueinander angepasst werden. Darüber hinaus sind die meisten der Steuerfunktionen der einzelnen Module selbst modular, so daß einzelne atmosphärische Gasregler, beispielsweise kann leicht ohne wesentliche Störung des Systems ausgetauscht werden.
Spezialisierten Verarbeitungskammern, beispielsweise eine für die mikroskopische Visualisierung und Manipulation von Zellkulturen, an das System leicht angepasst werden. Sowohl Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskop sind innerhalb des Systems (Figur 6) , so daß Zellen können lebende gefärbt werden, und Kolonien können in den gleichen atmosphärischen Bedingungen wie im Inneren t zerlegt werdener Inkubatoren. Verlegen von Kabeln durch abgedichtete Durchführungen in den Seitenwänden der Behandlungskammer ermöglicht Geräten wie Stromversorgungen und Computer außerhalb der Vorrichtung gehalten werden, in der Regel auf einem Wagen (6).
Die Behandlungskammern in der Zellproduktionsanlage haben einen anderen Luftstrom Muster als herkömmliche BSCs. Bei herkömmlichen BSCs fließt Luftstrom von einem zentralen Abluftöffnung nach unten und spaltet sich in zwei getrennte Ströme, die dann durch zwei verschiedene Belüftungsöffnungen im vorderen und hinteren Teil des Kabinetts des Boden aufgenommen. Im Gegensatz dazu hat das CPF eine einzige Entlüftungsöffnung in dem vorderen Teil der Decke. Luft strömt nach unten und in Richtung der Rückseite der Kammer, wo sie dann nach oben in eine Lufteinlassöffnung gesaugt wird. Obwohl die CPF von Natur aus sehr sauber ist, ist dieser einzigartige Luftstrom Muster bedeutet, dass Techniker müssen leicht ihre Technik anpassen das Risiko einer Kontamination zu reduzieren. Wie bei einem herkömmlichen BSC, ein Laborant should vermeiden, dass ihre Hände vor offenen Zellkulturplatten und Medien Flaschen platzieren. Jedoch, die die Richtung stromaufwärts wurde in dem CPF verändert
Die Zellproduktionsstätte Labor selbst ist ziemlich Standard und ist mit einem -20 ° C Gefrierschrank ausgestattet, einem -80 ° C Gefrierschrank, 4 ° C Kühlschrank, eine Zentrifuge und ein Wasserbad. Das Labor hat auch ein Waschbecken mit Fußschalter für die bequeme Freisprechbetrieb. Um diesem Labor eine funktionelle klinischen Zellproduktionsstätte zu werden, müssen jedoch einige zusätzliche Modifikationen noch vorgenommen werden. Erstens muss die Vorrichtung selbst aufgerüstet werden, um die Fähigkeit zu haben, flüchtige organische Verbindungen, Partikel zu überwachen, und die Konzentrationen an Chlordioxid, die zur Dekontamination eingesetzt wird. Zweitens wird eine Verarbeitungskammer mit einer FACS-Maschine enthält, kann über einen Puffermodul mit dem Rest der Vorrichtung untergebracht und angeschlossen werden. Dies wird für die Zellsortierung und Reinigung von tr ermöglichenansplantable Zellpopulationen unter den entsprechenden Umgebungsbedingungen. Schließlich muss die gesamte Vorrichtung innerhalb einer weichen Wand Reinraum untergebracht werden. Dies sorgt für eine Internationale Organisation für Normung (ISO) Klasse 8 – Umgebung für die Vorrichtung 5.
Die hohe Sterilität und computergesteuerten Charakter des CPF macht es zum idealen System für zukünftige Anwendungen mit zellbasierten Therapie und gute Herstellungsverfahren. Das Risiko einer Kontamination stark abgeschwächt, aber noch wichtiger, sind die Bedingungen für die Zellexpansion automatisch erfasst und durch das Computersystem archiviert. Abweichungen in Gaskonzentrationen, Temperatur, Feuchtigkeit und allen Ereignissen des Zugangs in das System werden rigoros dokumentiert. Dies kann erheblich dazu beitragen, wenn das Produkt Qualitätsprobleme zu untersuchen. Jedoch gibt es immer noch Beschränkungen auf. Die Verwendung von irgendwelchen und allen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (zB Medienkomponenten, Pipetten, Platten) sind separat zu dokumentieren. Hinzufügenitionally, gibt es eine Vielzahl von möglichen Problemen (einschließlich vieler Formen menschlicher Fehler), die durch das Überwachungssystem entstehen können, welche die CPF dokumentiert den Variablen völlig unabhängig sind. Somit bleibt der Bedarf an hoch qualifiziertes Personal und ausführliches Handbuch Dokumentation von Aufgaben an Ort und Stelle.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Biospherix für ihre Hilfe anzuerkennen, beim Erlernen der Xvivo geschlossenen Zellkultursystem zu verwenden, insbesondere Matt Freeman; das Personal von Miles & Kelley Construction Company, Inc. für ihre Arbeit in der Labor-Infrastruktur, insbesondere Russ Hughes Einrichtung; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung von Einrichtungen und Support Services für ihre Arbeit im Labor umbauen zu koordinieren, vor allem Adam Lukhard und Devin Hugie; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung für Informationssysteme für ihre Hilfe bei der Datenmanagement-Infrastruktur und Remote-Zugriff, insbesondere Viet Tran Einrichtung; Kinderkrankenhaus von Orange County Executive Management Team für ihre langjährige Unterstützung des Projekts, vor allem Dr. Maria Minon und Brent Dethlefs. Diese Arbeit wurde von Kinderkrankenhaus von Orange County und dem California Institute for Regenerative Medicin finanzierte durch Gewährung TR3-05476 zu PHS. Alle Autoren trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |