Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.
This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.
Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations.
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.
Celler odlade inom CPF ser inga förändringar i syre- eller koldioxidkoncentrationer när de flyttar från inkubatorn till behandlingskammaren till mikroskop kammare och tillbaka. Det är kritiskt att förhållandena i varje kammare är avstämda för den speciella inkubatorn i vilket cellerna hålls innan cellerna avlägsnas från inkubatorn. Atmosfären i apparaten kontinuerligt HEPA-filtreras och är anpassningsbar när det gäller syre och koldioxidkoncentrationer. Celler kan odlas vid standardkoncentrationer för PSC: er eller NSCs, 5% och 9%, respektive; eller alternativa koncentrationer kan väljas för olika celltyper eller för specifika experiment. Sålunda är anordningen matas med konstanta källor till syre med medicinsk renhet, koldioxid och kväve (Figur 4). Alla tre av dessa gaser med gas specifika grenrörssystem som garanterar konstant leveranser. Anordningen är också försedd med en kalibrerings gasblandning bestående av10% (± 0,01%) koldioxid i syre. De mångfaldiga system är inrymda utanför cellen produktionsanläggning och gaserna leds in i anläggningen genom taket. Kalibreringsgasen ligger inom anläggningen. Anordningen är dessutom matas med husvakuum, även genom taket. Med hjälp av ett elektroniskt system för övervakning och trådlös sändarenheterna, är utgångstryck alla grenrör övervakas kontinuerligt. I händelse av att något tryck faller utanför intervallet, är cellproduktionsanläggningen operatörer automatiskt ringde och medde så att lämpliga åtgärder kan vidtas.
Strömkraven för apparaten uppfylls av sex dedikerade 120 V kretsar ner från taket och kopplas till sjukhusets reservgeneratorer för att säkerställa en konstant tillförsel. Driften av apparaten styrs via mjukvara på en PC-baserad dator som drivs via en avbrottsfri strömförsörjning. Dessa effekter och datorarrangemangse till att systemet fungerar kontinuerligt även i händelse av en offentlig effekt systemfel. Mjukvaran som styr anordningen har ett användarvänligt grafiskt gränssnitt (Figur 1), som medger reglering av syre- och koldioxidkoncentrationer såväl som temperatur, fuktighet, och kammartryck. Värdena för alla dessa parametrar registreras kontinuerligt för att åstadkomma ett löpande register över alla anordningsparametrar. Dessa data säkerhetskopieras på en fjärrserver varje natt för att skydda sin integritet. Datorn och programvaran kan nås på distans genom administrativa användare att bedöma och / eller ändra någon parameter. Dessutom kan datorn och mjukvaran nås på distans, vilket möjliggör interaktiv bedömning av apparatparametrar och felsökning med lokala användare. En ytterligare larm sändande enheten är ansluten till apparaten så att cell produktionsanläggning aktörerna underrättas om något out-of-range tillstånd av apparaten. Fjärråtkomst capabilities tillåter logga in och bedömning av detaljerna i out-of-range tillstånd.
Anordningen är utformad som ett modulsystem både i ett makro och en mikro mening. Enskilda cellodlings moduler, exempelvis företagskuvöser och processkammare, kan anpassas med hänsyn till deras dimensioner och krav liksom i sin layout med avseende på varandra. Dessutom, de flesta av kontrollfunktionerna hos de olika modulerna själva modulär så att enskilda atmosfärisk gas styrenheter, till exempel, kan lätt bytas ut utan betydande störningar i systemet.
Specialiserade behandlingskammare, såsom en för mikroskopisk visualisering och manipulering av cellkulturer, kan lätt anpassas till systemet. Både fas-kontrast och fluorescensmikroskop är inne i systemet (figur 6), så att celler kan leva färgas, och kolonier kan dissekeras i samma atmosfäriska förhållanden som i than inkubatorer. Kabeldragning genom förseglade genomföringar i sidoväggarna hos behandlingskammaren tillåter utrustning såsom nätaggregat och datorer för att hållas utanför apparaten, vanligen på en vagn (Figur 6).
De behandlingskammare i cellen produktionsanläggningen har en annan luftflödesmönster än konventionella BSC. I konventionella BSC strömmar luftflödet ner från en central luftutsläppen och delas upp i två separata strömmar, som sedan tas upp av två olika luftintagen i den främre och bakre delen av skåpets golv. Däremot har CPF ett enda utlopp i den främre delen av taket. Luft strömmar nedåt och mot baksidan av kammaren, där den dras sedan uppåt till en luftintag. Även CPF är till sin natur mycket ren, innebär detta unika luftflödesmönster som tekniker har till svagt anpassa sin teknik för att minska risken för kontaminering. Som med en konventionell BSC, ett labb arbetare should undvika att placera sina händer uppströms öppna cellodlingsplattor och medieflaskor. Däremot har den riktning, som är uppströms ändrats på CPF
Cell produktionsanläggning laboratorium själv är ganska standard och är utrustad med en -20 ° C frys, -80 ° C frys, en 4 ° C kylskåp, en centrifug, och ett vattenbad. Laboratoriet har också en diskbänk med fot kontroller för bekväm handsfree-användning. För att detta laboratorium för att bli en funktionell klinisk cell produktionsanläggning dock flera ytterligare modifieringar måste ändå göras. För det första måste själva apparaten att uppgraderas för att ha kapacitet att övervaka flyktiga organiska föreningar, partiklar, och koncentrationer av klordioxid som används för dekontaminering. För det andra kan en behandlingskammare som innehåller en FACS maskin inrymmas och ansluten till resten av apparaten via en buffert modul. Detta gör det möjligt för cellsortering och rening av transplantable cellpopulationer under lämpliga miljöförhållanden. Slutligen måste hela anordningen inrymd i en mjuk vägg renrum. Detta ger en International Organization for Standardization (ISO) klass 8 miljö för apparaten 5.
Den höga sterilitet och datorstyrd karaktär CPF gör det till ett idealiskt system för framtida applikationer med cellbaserad behandling och god tillverkningsprocesser. Risken för kontaminering i hög grad mildras, men ännu viktigare, är villkoren för cellexpansion automatiskt registreras och arkiveras av datorsystemet. Avvikelser i gaskoncentrationer, temperatur, luftfuktighet och alla händelser att komma in i systemet är noggrant dokumenterade. Detta kan vara till stor hjälp när man utreder problem produktkvalitet. Det finns dock fortfarande begränsningar. Användningen av alla eventuella reagenser och förnödenheter (t.ex. mediakomponenter, pipetter, plattor) ska dokumenteras separat. Lägg tillitionally finns en mängd potentiella problem (inklusive många former av mänskliga fel) som kan uppstå som är helt orelaterade till de variabler som dokumenteras av CPF övervakningssystem. Således kvarstår behovet av välutbildad personal och utförlig manuell dokumentation av uppgifter på plats.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för personalen på Biospherix för deras hjälp att lära sig att använda Xvivo medföljande cellodlingssystem, särskilt Matt Freeman; personal Miles & Kelley Construction Company, Inc. för deras arbete med att inrätta laboratorieinfrastrukturen, särskilt Russ Hughes; personalen på barnsjukhuset i Orange County departementet faciliteter och stödtjänster för sitt arbete med att samordna laboratorieombyggnads, särskilt Adam Lukhard och Devin Hugie; personalen på barnsjukhuset i Orange County Institutionen för informationssystem för deras hjälp med att installera infrastruktur datahantering och fjärråtkomst, särskilt Viet Tran; barnsjukhuset i Orange County ledningsgrupp för sitt långvariga stöd för projektet, särskilt Dr Maria Minon och Brent Dethlefs. Detta arbete har finansierats av barnsjukhuset i Orange County och California Institute för regenerativ Medicine genom bidrags TR3-05476 till PHS. Alla författare har bidragit lika för detta arbete.
Equipment | |||
Xvivo System | Biospherix | custom made | |
Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
Reagents | |||
DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
Accutase | Millipore | SCR005 | |
Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
Consumable Supplies | |||
2mL Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
5mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
10mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
25mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
50mL Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
12-well plate | Corning | 353043 | |
T25 flask | TPP | 90026 | |
T-75 flask | TPP | 90076 | |
20uL pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
200uL pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
1000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
Bleach | Clorox | A714239 |