Les protocoles actuels pour maintenir les cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées (iMOP) et la différenciation otique sont décrits. Les conditions de culture et les marqueurs moléculaires qui indiquent la différenciation en épithélium sensoriel et neurones du ganglion spiralé (SGN) sont mis en évidence.
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Article de méthode
Lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique
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Résumé
Résumé
L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) ou de cellules souches embryonnaires (ESC) pour les thérapies de remplacement cellulaire est très prometteuse. Plusieurs limites, notamment de faibles rendements et des populations hétérogènes de cellules différenciées, entravent la progression des thérapies par cellules souches. Une lignée cellulaire de progéniteur otique multipotent immortalisé (iMOP) a été générée pour faciliter la différenciation efficace d’un grand nombre de cellules ciliées fonctionnelles et de neurones ganglionnaires spiralés (SGN) pour les thérapies de remplacement des cellules de l’oreille interne. À partir de cultures dissociées de cellules iMOP uniques, des protocoles favorisant la sortie du cycle cellulaire et la différenciation par retrait du facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF) ont été décrits. Une diminution significative des cellules proliférantes après le retrait du bFGF a été confirmée à l’aide d’un test de prolifération cellulaire EdU. Parallèlement à une diminution de la prolifération, la différenciation réussie a entraîné l’expression de marqueurs moléculaires et des changements morphologiques. L’immunocoloration de Cdkn1b (p27KIP) et de Cdh1 (E-cadhérine) dans les otosphères dérivées d’iMOP a été utilisée comme indicateur de différenciation en épithélium sensoriel de l’oreille interne, tandis que l’immunocoloration de Cdkn1b et Tubb3 (β-tubuline neuronale) a été utilisée pour identifier les neurones dérivés d’iMOP. L’utilisation des cellules iMOP fournit un outil important pour comprendre les décisions relatives au destin cellulaire prises par les progéniteurs neurosensoriels de l’oreille interne et aidera à développer des protocoles pour générer un grand nombre de cellules ciliées et de SGN dérivés d’iPSC ou d’ESC. Ces méthodes accéléreront les efforts de génération de cellules otiques pour les thérapies de remplacement.
Introduction
Les organes de l’oreille interne, la cochlée, l’utricule, le saccule et trois canaux semi-circulaires, interviennent dans la capacité d’entendre et d’équilibrer. À l’intérieur de la cochlée, les cellules ciliées convertissent les sons en signaux électriques qui sont relayés aux neurones du ganglion spiralé (SGN). Les SGN déclenchent des potentiels d’action pour propager les signaux neuronaux à travers le circuit auditif. Les mutations génétiques, les médicaments ototoxiques et l’exposition à des sons forts contribuent à la mort des cellules ciliées et du SGN qui entraînent une perte auditive1 à 4. Une fois perdues, ces cellules ne sont pas remplacées. L’u....
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Protocole
1. Maintenir autorenouvellement dans les cellules de IMOP
- Préparer IMOP milieux de culture: DMEM / F12, supplément 1X B27, 25 pg / ml carbénécilline et 20 ng / ml de bFGF. Faire 50 ml de IMOP milieux de culture en utilisant des réactifs stériles. Réchauffez 49 ml de DMEM / F12 dans un 50 ml conique dans un bain d'eau à 37 °.
- Thaw 50X B27 supplément et 100 mg / ml carbénécilline aliquotes stérilisées par filtration, pendant 5 min dans un bain d'eau à 37 ° C. Dégeler 100 pg / ml de bFGF aliquote à TA. Ajouter 1 ml 50X B27, 10 pl de 100 pg / ml de bFGF et 12,5 pi de 100 mg / ml carbénécilline dans DMEM / F12.
- Utilisez 3 ml....
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Résultats
bFGF Retrait Diminutions prolifération dans des cellules IMOP
Pour diminuer la capacité de prolifération des cellules IMOP et initier la différenciation des cellules IMOP, le bFGF a été retiré à partir de la culture. Pour confirmer que le retrait du facteur de croissance diminue la prolifération, EdU incorporation a été utilisé comme un test de prolifération. Le pourcentage de cellules qui a incorporé de otosp.......
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Discussion
Suivi Cultures IMOP
Un protocole pour le maintien de l'auto-renouvellement et la promotion de la différenciation d'une lignée cellulaire de IMOP roman est décrit et formats de placage supplémentaires sont inclus (tableau 1). Plusieurs étapes critiques qui aident à la dilatation de routine et la différenciation des cellules IMOP sont notés. Semblable à des cultures de cellules souches pluripotentes, cellules IMOP ont théoriquement une durée de vie ind.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les travaux ont été soutenus en partie par le Fonds de dotation de la chaire de développement du corps professoral Duncan et Nancy MacMillan (K.Y.K.), la subvention de recherche biomédicale Busch (K.Y.K.) et la subvention de développement du corps professoral Rutgers (K.Y.K.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| CoolCell LX Contenants de congélation cellulaire sans alcool | BioCision | BCS-405 | |
| Flacons cryogéniques (2 ml) ; | Corning | 430654 | |
| 1,5 Epaisseur (ronde 12 mm) | Microscopie électronique Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium Life | Technologies | 21103 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank’s Solution saline équilibrée (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Supplément de B27 (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stocké sous forme de 1 ml d’aliquotes de |
| L-Glutamine (200 mM) ; | Life Technologies | 25030-081 | Stocké sous forme d’aliquotes de 5 ml |
| Laminine de souris naturelle Life | Technologies | 23017-015 | Stocké sous forme d’aliquotes de 1 mg/ml |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 ; | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Milieu de cryoconservation | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stocké sous forme de 10 mg/ml 100 µ ; l aliquotes |
| Moxi Z Mini Compteur de Cellules Automatisé | Orflo ; | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo ; | MXC002 | |
| Facteur de croissance des fibroblastes murins recombinants, basique (bFGF) | Peprotech | 450-33 | remis en suspension dans 0,1 % de BSA dans H20 et stocké sous forme d’aliquotes de 20 mg/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Remis en suspension dans 1X PBS et stocké sous forme de 10 mg/ml 100 µ ; l aliquotes |
| Carbenicilline, sel disodique | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Remise en suspension dans 10 mM Hepes pH 7,4 et stockée sous forme d’aliquotes de 100 mg/ml |
| Pipette de 5 ml emballée individuellement (200/caisse) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Pipette de 10 ml emballée individuellement (200/caisse) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Plaque 24 puits traitée Biolite | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Plaque 6 puits traitée Biolite Thermo | Fisher Scientific | 130184 ; | |
| Plat de 6 cm traité pour culture tissulaire | Thermo Fisher Scientific | 130181 ; | |
| EMD Millipore Millex Seringue stérile PVDF Taille des pores : 0,22 &mu ; m | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne pointes de pipette filtrantes 0,1 - 10 &mu ; l embout de filtre allongé | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne pointes de pipette de filtre 1 - 20 &mu ; l embout de filtre | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne embouts de pipette de filtre 1 - 200 &mu ; l ; pointe de filtre | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne pointes de pipette de filtre 101 - 1000 &mu ; l embout filtrant | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml tubes coniques stériles 20 sacs de 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml tubes coniques stériles 20 sacs de 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
Références
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary'....
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to the Authors section in: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.
One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali
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