Différences entre les sexes dans la souris hippocampiques astrocytes après<em> In-Vitro</em> ischémie
Summary
Les astrocytes sont l'un des principaux acteurs les plus importants dans le système nerveux central (SNC). Ici, nous rapportons une méthode pratique de sexué hippocampique protocole de culture d'astrocytes afin d'étudier les mécanismes sous – jacents de la fonction des astrocytes dans les chiots mâles et femelles néonataux après une ischémie in vitro.
Abstract
Astrogliosis suivante hypoxie / ischémie (HI) lésion cérébrale la PI joue un rôle dans l'augmentation de la morbidité et de mortalité chez les nouveau-nés. Des études cliniques récentes indiquent que la gravité des blessures du cerveau semblent être le sexe à charge, et que les nouveau – nés de sexe masculin sont plus sensibles aux effets de la lésion cérébrale HI liée, ce qui entraîne des résultats neurologiques plus graves que chez les femmes ayant des lésions cérébrales comparables. Le développement de méthodes fiables pour isoler et maintenir les populations hautement enrichies de astrocytes hippocampique sexué est essentiel de comprendre la base cellulaire des différences entre les sexes dans les conséquences pathologiques de HI néonatale. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour créer des cultures hippocampiques spécifiques du sexe astrocytes qui sont soumises à un modèle d'ischémie in vitro, la privation d'oxygène-glucose, suivie par une réoxygénation. astrogliosis réactif subséquent a été examiné par immunostaining pour la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) et S100B. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier le rôle des hommes et des astrocytes hippocampiques femelles après néonatale HI, séparément.
Introduction
Les astrocytes sont l'un des principaux acteurs les plus importants dans le système nerveux central (SNC). nombre croissant de preuves indique que les rôles des astrocytes sont plus de fournir un soutien neuronal. En fait, le rôle des astrocytes dans des conditions physiologiques peuvent être très complexes, telles que le guidage de la migration des axones en développement 1, la régulation du système nerveux central flux sanguin 2, le maintien de l'homéostasie du pH du liquide interstitiel synaptique 3, et en participant à la barrière hémato – encéphalique 4 et 5 la transmission synaptique. Dans des conditions pathologiques, les astrocytes réagissent à des blessures avec un processus appelé astrogliosis réactif dans lequel la morphologie, le nombre, l' emplacement, la topographie (par rapport à la distance de l' insulte) et la fonction des astrocytes peuvent changer d'une manière hétérogène 6,7. Astrogliosis observée après néonatale encéphalopathie hypoxique ischémique peut-être contribuer à la morbidité et la mortalité des nouveau-nés <sup> 8.
Des études cliniques et expérimentales récentes montrent que la sévérité des lésions cérébrales semble être dépendant du sexe et que les nouveau-nés mâles sont plus sensibles aux effets de l'hypoxie / ischémie (HI), les lésions cérébrales concernant la PI, ce qui entraîne des résultats neurologiques les plus graves par rapport à les femmes ayant des lésions cérébrales comparables 9-11. Bien que la localisation de la blessure dépend de l'âge gestationnel et la durée et la gravité de l'insulte, l'hippocampe est l'une des régions les plus couramment effectuées dans le SNC après terme néonatale HI, et augmenté astrogliosis hippocampique a été confirmée par la régulation des la protéine fibrillaire gliale acide (GFAP) 3 jours après l'HI néonatale 7,10,12,13. Les différences de sexe en fonction des astrocytes ont été présentés dans les deux nouveau – nés et les rongeurs adultes après une ischémie cérébrale 14,15. En outre, la sensibilité astrocytaire mâle à une ischémie in vitro a été démontré par une augmentation de cell la mort par rapport à astrocytes corticales femmes dans la culture 16.
Les différences sexuelles commencent in utero et se poursuivent jusqu'à la mort 17. Au cours de la dernière décennie, l'importance d'inclure les sexes dans des conditions expérimentales en culture cellulaire et in vivo des études ont été l'accent de l'Institut de médecine et de NIH à rechercher des connaissances fondamentales dans les différences entre les sexes observées dans des conditions physiologiques et pathologiques 17,18 . Développement de méthodes fiables pour isoler et maintenir les populations de astrocytes hippocampique sexué est essentiel de comprendre la base cellulaire des différences entre les sexes dans les conséquences pathologiques de HI néonatale. La présente étude a été conçue pour fournir les techniques pour préparer enrichies cultures de souris nouveau-nés astrocytes hippocampique par sexe afin d'évaluer le rôle des astrocytes GFAP-immunoréactives suivants Oxygen / Glucose Privation (OGD) et réoxygénation (REOX), induisantHI dans le milieu de culture cellulaire. Cette technique peut être utilisée pour tester toute hypothèse concernant les astrocytes hippocampiques chez les mâles et les femelles néonataux dans des conditions normoxiques et ischémiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afin d'étudier les différences entre les sexes dans les propriétés et la fonction des astrocytes dans des conditions physiologiques et pathologiques, la préparation des astrocytes primaires sexués dans la culture cellulaire est un outil important à utiliser. Dans la présente étude , nous rapportons une population homogène hautement enrichi d'astrocytes hippocampiques sexués de nouveau – né (P0-P2) C57BL / 6 (type sauvage) ou K19F (GFAP de null) souriceaux très efficace et une méthode reproductible …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
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