マウス海馬アストロサイトにおける性差後<em>インビトロ</em>虚血
Summary
星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。ここでは、 インビトロ虚血後の男性と女性の新生児の仔にアストロサイト機能の基礎となるメカニズムを研究するために、有性海馬アストロサイト培養プロトコルの実用的な方法を報告しています。
Abstract
低酸素症/虚血（HI）関連脳損傷後のアストログリオーシスは、新生児における罹患率及び死亡率の増加に役割を果たしています。最近の臨床研究では、脳損傷の重症度は、セックスは依存しているように表示されていることを示しており、男性の新生児は、同等の脳損傷で、女性に比べて、 より深刻な神経学的転帰が得られ、HI-関連の脳損傷の影響をより受けやすいこと。有性海馬アストロサイトの高度に濃縮された集団を分離し、維持するための信頼性の高い方法の開発は、新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究では、再酸素化に続くインビトロ虚血、酸素-グルコース欠乏のモデルに供される性別特定海馬星状細胞培養物を作成するための方法を記載します。その後の反応性アストログリオーシスはimmunostaiで調べましたグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）とS100BのためのNing。この方法は、個別に、新生児HI以下の男性と女性の海馬アストロサイトの役割を研究するための有用なツールを提供しています。
Introduction
星状細胞は、中枢神経系（CNS）において最も重要な主要なプレーヤーの一つです。証拠の成長体は、アストロサイトの役割は、ニューロンのサポートを提供するよりもあることを示しています。実際には、生理的条件下でアストロサイトの役割は、このような、中枢神経系の血流2を規制、開発軸索1の移動を案内するシナプス間質液3のpHホメオスタシスを維持し、血液脳関門に参加するように、非常に複雑になることがあります4とシナプス伝達5。病理学的条件の下では、アストロサイトは、反応性アストログリオーシス（傷害からの距離に対する）における形態、数、位置、地形と呼ばれるプロセスで傷害に応答し、アストロサイトの機能は、異種の方法6,7に変更されることがあります。多分新生児の罹患率と死亡率に貢献する新生児低酸素性虚血性脳症後に見られる星膠症<s> 8まで。
最近の臨床と実験研究は、脳損傷の重症度に比べて男性の新生児は、より深刻な神経学的転帰が得られ、低酸素/虚血（HI）関連脳損傷の影響をより受けやすいこと、セックス依存性であることが表示され、ことを示しています同程度の脳損傷9-11とメス。傷害の局在は妊娠期間と期間と侮辱の重症度に依存するが、海馬は用語新生児HI後にCNSにおいて最も一般的に行なわ地域の一つであり、海馬アストログリオーシスを増加させたアップレギュレーションのによって確認されていますグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）新生児HI 7,10,12,13後の3日間。アストロサイトの機能における性差は、脳虚血14,15後の両方の新生児と成人の齧歯類に示しました。また、 インビトロ虚血にオスアストロサイト感受性は増加セル画によって示されました文化16の女性皮質アストロサイトと比較してリットル死。
セックスの違いは、 子宮内開始し、死亡17まで継続します。過去10年間、細胞培養およびin vivoでの研究の実験条件で男女を含むことの重要性は、医学およびNIHの研究所の重点は生理学的および病理学的条件17,18に見られる性差に基本的な知識を求めるようになっています。有性海馬アストロサイトの集団を分離し、維持するための信頼できる方法の開発が新生児HIの病理学的結果における性差の細胞の基礎を理解することが不可欠です。本研究は、誘導、酸素/グルコース欠乏（OGD）と再酸素化（REOX）以下のGFAP免疫反応性アストロサイトの役割を評価するために、新生児マウスからの濃縮された性特異的海馬星状細胞培養物を準備する技術を提供するように設計されました細胞培養環境でHI。この技術は、正常酸素および虚血条件下新生児男性および女性における海馬アストロサイトに関連する任意の仮説を試験するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
生理学的および病理学的条件の下での特性とアストロサイトの機能における性差を研究するために、細胞培養における有性初代星状細胞の調製は、利用するための重要なツールです。本研究では、in vitroで新生児から有性海馬アストロサイトの高濃縮均質な集団（P0-P2）C57BL / 6（野生型）またはK19F（GFAPヌル）仔マウス高効率と文化に再現性のある方法を報告しています。この方法論を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clinical and Translational Science Award program of NCATS UL1 TR0000427 and KL2 TR000428 (Cengiz P), UL1TR000427 to the UW ICTR from NIH/NCATS and funds from Waisman Center (Cengiz P), K08 NS088563-01A1 from NINDS (Cengiz P) and NIH P30 HD03352 (Waisman Center), NIH/NINDS 1K08NS078113 (Ferrazzano P). We would like to thank Albee Messing, PhD, for providing us the GFAP knockout mice.
Materials
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 0.25% Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine 12mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | cell culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 | |
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